氧化应激在胰腺纤维化中的作用及其分子机制的实验研究

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第一部分氧化应激在长期高脂饮食诱导的胰腺损伤中的作用目的:探讨长期高脂饮食对胰腺组织的影响及其机制。方法:体重170-190g的雄性Wistar大鼠分为对照组和高脂饮食组。对照组:普通饲料喂养,自由饮水。高脂饮食组:给予高脂饲料喂养(2%胆固醇,10%猪油,88%普通饲料),自由饮水。高脂喂养2周后进入实验。于实验开始时、实验第2周末及实验第20周末分别采取静脉血,分离血清,-20℃冻存,集中检测三酰甘油、胆固醇、胰淀粉酶、胰脂肪酶、葡萄糖。于实验第20周末,活体显微镜下观察胰腺微循环状况;墨水灌注观察微循环形态学变化;取胰腺组织,常规H&E染色观察胰腺组织改变;透射电镜观察胰腺超微结构改变;苦味酸-天狼猩红染色观察胶原形成;免疫组织化学染色观察NF-κB/p65、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和α-平滑肌动蛋白(α-SMA)表达;RT-PCR法检测胰腺组织中NF-κB/p65、ICAM-1、TNF-α、α-SMA mRNA表达,免疫印迹检测胰腺组织中NF-κB/p65、ICAM-1、α-SMA表达。结果:1.一般情况:20周末,HFD组大鼠体重明显高于对照组(524.40±51.51,434.60±25.72,P=0.013)。两组均无大鼠死亡,大鼠未出现腹泻、多尿或消瘦等。局部解剖发现,HFD大鼠皮下、胃底及胰腺周围有大量脂肪沉积。2.血液检测:2周后,HFD大鼠出现高脂血症。20周末,HFD大鼠血清TG、TCH增高更明显,而对照组大鼠血脂水平变化不大,两组大鼠比较血清TG、TCH水平有显著差异。3.胰腺活体微循环检测和微血管密度观察:HFD大鼠胰腺微血管血流速度(639.70±104.63μm/s)较对照组大鼠降低15.39%(756.08±98.98μm/s)(P=0.008)。HFD大鼠胰腺微血管直径较对照组大鼠增加(22.72±7.11μm,15.81±5.13μm,P=0.016)。高脂喂养大鼠胰腺微血管形态模糊,灌注差,有些微血管不连续且微血管密度较对照组大鼠明显降低(1.83±0.72,3.08±1.38,P=0.013)。4.H&E染色:光镜下观察,高脂饮食大鼠胰腺腺泡及胰岛细胞萎缩、空泡变,小叶间隙增宽,小叶内或小叶间有淋巴细胞浸润。偶见有胶原纤维。5.透射电镜观察:HFD组大鼠胰腺腺泡细胞核膜肿胀、模糊,核变小,内质网明显扩张;线粒体嵴模糊或消失;血管内皮细胞肿胀,内皮细胞向腔内指状突起;内皮细胞表面有破损,细胞间隙增宽,内皮连续性局部中断。内皮细胞内质网扩张,线粒体肿胀、嵴模糊。6.天狼猩红染色:高脂喂养的大鼠胰腺组织内有散在的胶原纤维,对照组大鼠未见胶原形成。7.免疫组化染色:高脂喂养大鼠胰腺组织可见NF-κB/p65、ICAM-1和α-SMA的强表达。8.MDA、SOD检测:HFD组大鼠胰腺组织MDA含量(42.77±16.53nmol/mgprot)较对照组(9.89±6.15 nmol/mgprot)显著增高(P=0.022)而SOD活性(36.91±8.49U/mgprot)较对照组(91.87±41.35U/mgprot)降低(P=0.039)。9.RT-PCR:高脂饮食大鼠胰腺组织NF-κB/p65、ICAM-1、TNF-α和α-SMAmRNA水平均明显高于正常饮食组。10.蛋白质免疫印迹分析:高脂组大鼠胰腺组织NF-κB/p65、ICAM-1、α-SMA的表达显著高于正常饮食组。结论:长期高脂饮食引起胰腺组织细胞损伤和早期纤维化发生。这种损伤与胰腺组织内氧化应激增强有关。氧化应激增强继发于脂质代谢紊乱和胰腺微循环障碍。其分子机制可能与NF-κB活化及其下游调节分子ICAM-1等的过表达有关。第二部分ICAM-1在氧化应激诱导的大鼠胰腺纤维化中的表达及其反义寡核苷酸的干预作用目的:探讨ICAM-1在氧化应激诱导的大鼠胰腺纤维化中的作用及其反义寡核苷酸的干预作用。方法:体重170-190g的雄性Wistar大鼠分为4组。①正常对照组(normalcontrol,N):给予双蒸水腹腔注射,每周2次,每次约1ml,共6周。②ICAM-1反义寡核苷酸组(ICAM-1 antisense oligonucleotide,ASON):给予DDC750mg/kg体重腹腔注射,每周2次,双蒸水稀释。每次DDC注射前半小时给予ASON注射。ASON双蒸水稀释,按0.5mg/kg体重(15 OD/kg体重)腹腔注射,每周2次,共6周。③错配反义寡核苷酸对照组(controlmixed ICAM-1 antisense oligonucleotide,Mix):方法同ASON组。④DDC对照组(DDC):单纯给予DDC腹腔注射,750mg/kg体重,每周2次,共6周。于实验末取胰腺组织,常规H&E染色观察胰腺组织改变;天狼猩红染色观察胶原;免疫组织化学染色观察细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和α-平滑肌动蛋白(α-SMA)表达;RT-PCR法检测胰腺组织中ICAM-1、α-SMA和ConⅠmRNA表达,免疫印迹检测胰腺组织ICAM-1、α-SMA表达。结果:1.一般情况:大鼠腹腔注射双蒸水、ASON和错配ASON后均无不良反应,但腹腔注射DDC后立即出现两侧腹部收缩、身体拉长及步态不稳等不良反应,约15min后自行缓解。2.H&E染色:DDC组和错配寡核苷酸组(Mix组)大鼠胰腺腺泡细胞和胰岛细胞空泡变和萎缩明显,胰腺内由胶原纤维形成,小叶间隙增宽。血管、胆管周围和小叶间有淋巴细胞浸润。ASON组上述表现明显减轻。对照组大鼠胰腺结构清晰未见空泡变。3.天狼猩红染色:DDC组和错配寡核苷酸组(Mix组)大鼠胰腺组织内有明显胶原纤维形成,ASON组大鼠有少量胶原,而正常对照组大鼠未见明显胶原存在。定量检测胶原面积比,发现DDC组和Mix组胶原含量最高,而ASON和正常对照组胶原含量最少。4.免疫组化染色:DDC组和错配寡核苷酸组(Mix组)大鼠胰腺组织ICAM-1和α-SMA高表达,ASON组低表达而正常对照组无α-SMA表达。5.RT-PCR:DDC组、Mix组大鼠胰腺组织ICAM-1、α-SMA和ConⅠmRNA水平均明显高于正常对照组。ASON组则显著低于DDC和Mix组。5.蛋白质免疫印迹分析:DDC组、Mix两组大鼠胰腺组织ICAM-1、α-SMA水平明显高于正常对照组;ASON组大鼠胰腺组织中ICAM-1、α-SMA水平与对照组比较无差别,而与DDC组比较则显著降低。结论:氧化应激可引起胰腺纤维化损伤,其分子机制与胰腺组织ICAM-1表达上调有关;应用ICAM-1的反义寡核苷酸可抑制胰腺星状细胞活化和胶原形成,可有效保护氧化应激诱导的胰腺纤维化损伤。第三部分NF-κB抑制剂柳氮磺胺吡啶对氧化应激诱导的大鼠胰腺纤维化干预的研究目的:探讨NF-κB抑制剂柳氮磺胺吡啶对氧化应激诱导的大鼠胰腺组织损伤的保护和治疗作用。方法:体重170-190g的雄性Wistar大鼠分为5组。①正常对照组(normalcontrol,N):大鼠仅给予双蒸水腹腔注射,每周2次,共10周。②DDC+小剂量柳氮磺胺吡啶预防组(DS1):大鼠给予DDC750mg/kg体重腹腔注射,每次注射DDC前2小时先行腹腔内注射柳氮磺胺吡啶(10mg/kg体重)。每周2次,共10周。③DDC+大剂量柳氮磺胺吡啶预防组(DS2):大鼠给予DDC750mg/kg体重腹腔注射,每次注射DDC前2小时先行腹腔内注射柳氮磺胺吡啶(Sigma-Aldrich)(100mg/kg体重)。每周2次,共10周。④柳氮磺胺吡啶治疗组(DS3):DDC按750mg/kg体重的剂量腹腔注射,每周2次,共10周。第11-12周给予腹腔内注射硫氮磺胺吡啶(100mg/kg体重),每2天1次。⑤DDC对照组(DDC):单纯给予DDC腹腔注射,750mg/kg体重,每周2次,共10周。实验结束后取胰腺组织,常规H&E染色观察胰腺组织改变;苦味酸-天狼猩红染色观察胶原;免疫组织化学染色观察NF-κB/p65、ICAM-1和α-SMA表达;RT-PCR法检测胰腺组织中NF-κB/p65、ICAM-1、TNF-α、α-SMA和ConⅠmRNA表达,免疫印迹检测胰腺组织中NF-κB/p65、ICAM-1、α-SMA表达。结果:1.一般情况:大鼠注射柳氮磺胺吡啶后出现尿黄,多于第二天消失。2.H&E染色:镜下观察,对照组大鼠胰腺结构清晰,而DDC组大鼠胰腺腺泡细胞和胰岛细胞空泡变和萎缩明显,胰腺内由胶原纤维形成,小叶间隙增宽。血管、胆管周围和小叶间有少量淋巴细胞浸润。DS1组稍有减轻,DS2组和DS3组则较DDC组明显减轻。3.天狼猩红染色:DDC组和DS1组大鼠胰腺组织小叶间隙、胆管和血管周围有明显胶原纤维形成。而DS2、DS3组大鼠有少量胶原,正常对照组大鼠未见胶原形成。4.免疫组化:DDC组和DS1组两组大鼠胰腺组织NF-κB/p65、ICAM-1和α-SMA高表达,而DS2、DS3组则呈现低表达。对照组大鼠未见α-SMA表达。5.PCR:结果显示,DDC组、DS1组大鼠胰腺组织NF-κB/p65、ICAM-1、TNF-α和ConⅠmRNA水平均明显高于正常对照组。DS2、DS3组上述分子的mRNA水平较DDC组降低而与正常对照组比较无差别。6.免疫印迹:检测结果显示,DDC组、DS1两组大鼠胰腺组织NF-κB/p65、ICAM-1、α-SMA水平明显高于正常对照组;DS2、DS3组大鼠胰腺组织中NF-κB/p65、ICAM-1和α-SMA水平与对照组比较无差别,而与DDC、DS1组比较则显著降低。结论:柳氮磺胺吡啶通过抑制NF-κB活化及其下游调节分子的表达而对氧化应激诱导的胰腺损伤有保护和治疗作用。
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