研究背景创伤性脑损伤(TBI)是致死致残的重要病因之一。在美国每年约有200万人发生TBI,几乎三分之一脑损伤的患者是儿童和青年人群[1,2]。在世界范围内,TBI的发生率还在不断增加,交通事故、人身攻击等是TBI发生的主要原因[3-5],尤其是机动车辆的广泛使用,以及战争环境下的爆炸伤是导致TBI的重要原因[6-8]。创伤性脑损伤的伤情非常复杂,可能会导致不同程度的挫伤、弥漫性轴索损伤、出血、缺氧和神经退行性疾病[9-12],从病理生理学角度上,创伤性脑损伤大致可分为两个阶段即:原发性脑损伤和继发性脑损害[13-16],原发性损伤源于环境中机械外力直接作用于颅骨和脑,瞬间造成脑部神经细胞死亡,属于不可逆的机械损伤[17-19]。而继发性脑损害是指在原发性损伤的基础上,所产生的后续脑组织损伤,可持续少至数小时,多达数天[20-22]。继发性脑损害机制包括一系列过程,如兴奋性神经递质的释放(谷氨酸兴奋毒性)、线粒体功能障碍、神经细胞凋亡、脂质降解、炎性反应、钙超载和自由基损伤等[23-28]。上述机制被证明与细胞早期死亡、程序性细胞死亡以及细胞内部的自噬相关,此过程需要比较长的时间,其中还存在许多可调节的生物分子靶点[29-31],这些生物分子靶点研究在创伤性脑损伤的诊断和治疗中可能发挥重要作用[32-34],因此,对继发性神经损害相关的生物靶向分子和信号通路进行调控,已逐渐在治疗创伤性脑损伤中形成共识。据研究报道,Homer是重要的突触后致密物的支架蛋白,Homer1作为Homer蛋白家族的一员,具有形成突触结构和介导突触后信号转导的功能[35-37]。进一步研究证明,由即早基因编码的homer1亚型蛋白,具有调节受体聚集和转运、维持细胞内钙稳态和形成细胞内分子复合物等功能[38-40]。大量的临床前研究已经证明,homer1亚型蛋白与许多神经系统疾病,如疼痛、精神发育迟缓综合征,阿尔茨海默病、精神分裂症、药物成瘾症和创伤性脑损伤等疾病相关[41-43]。homer1a(也称为vesl-1,短型homer1),是第一个被分离出来的homer亚型蛋白。研究表明,homer1a蛋白由即早基因(ieg)编码,正常状态下维持低水平表达,在神经元激活后表达量迅速增高[44-46]。然而,单一的生物标记物不足以反映脑组织损伤的全谱。病理状态下的关键分子、信号通路和网络依然有待于深入探索。实验目的本研究目标:(1)建立稳定的脑损伤模型并观察其病理学、形态学及行为学变化。使用蛋白质谱的方法系统性鉴定分析创伤性脑损伤后蛋白的变化差异,为其潜在的发生机制提供新依据。(2)研究homer1a蛋白在创伤性脑损伤后的改变与作用,并使用蛋白质谱的方法探索homer1a下游分子网络及信号通路的变化,包括mapk及notch等。实验方法(1)动物模型:使用c57bl/6小鼠建立重物自由落体闭合性脑损伤模型;(2)脑损伤的评估:脑含水量和神经功能评分;(3)病理学:he染色、免疫荧光、免疫组化及tunel染色;(4)分子生物学:实时荧光定量pcr、反转录pcr及免疫印迹法进行研究;(5)动物行为学:旷场实验、高架迷宫实验及水迷宫实验;(6)homer1a表达调节研究:皮层注射homer1a过表达载体、homer1a基因敲除小鼠。(7)蛋白组学:运用一维凝胶电泳结合非标记定量蛋白组方法、geneontology(go)和ingenuitypathwayanalysis(ipa)软件的应用;实验结果创伤性脑损伤可引起脑水肿和神经功能失调;he染色结果显示,损伤后24小时小鼠皮层及海马中神经元细胞死亡数目明显增加,神经元细胞发生核固缩现象。tunel染色结果显示tunel阳性细胞数目亦明显增多。westernblot结果显示,homer1a在创伤性脑损伤后出现表达升高,而homer1b/c则未出现明显变化,免疫荧光及免疫组化结果同上。通过认知学及动物行为学方法(水迷宫、高架十字迷宫及旷场试验),结果显示,创伤性脑损伤可造成小鼠学习记忆功能的损害,并产生严重的抑郁。蛋白组学结果,大量蛋白及信号通路参与创伤性脑损伤的过程,其中包括经典的损伤标记物GFAP及S100B等,还包括Homer家族分子(Homer1,Homer2及Homer1a)。为进一步研究,我们使用了Homer1a基因敲除小鼠以及Homer1a过表达载体。通过上调Homer1a,可有效降低脑水肿的程度及神经功能评分,在Homer1a基因敲除小鼠则会加重脑水肿的程度和神经功能失调。Western blot结果显示,脑损伤后24小时活化caspase-3的表达在野生型小鼠中明显升高,Homer1a基因敲除后表达升高更加明显,而上调Homer1a则降低脑损伤后活化caspase-3的表达。动物行为学结果显示,上调Homer1a可以在一定程度上逆转脑损伤引起的学习记忆损害及焦虑情绪,而Homer1a基因敲除的作用相反。利用质谱分析Homer1a基因敲除后蛋白组的变化,在检测出的6529种蛋白中,237种蛋白表达差异在2倍以上,生物信息学软件分析出泛素化信号通路,axonal guidance通路,蛋白激酶A通路,ERK/MAPK通路及Notch通路参与其中。通过功能疾病数据库分析,Homer1a基因敲除可影响基底节细胞功能、突触功能等。研究显示,Homer1a基因敲除后p-ERK,p-CREB和NICD的表达升高,GluR1及GluR2/3的表达降低。实验结论实验数据表明,Homer1a在创伤性脑损伤后具有神经保护的功能,可有效降低TBI后脑水肿的程度及神经功能评分,在一定程度上逆转TBI引起的学习记忆损害及焦虑情绪,并抑制神经细胞死亡。Homer1a可参与多种信号通路及分子网络,发挥着重要的作用,特别是在泛素化信号通路,ERK/MAPK通路及Notch通路的调控作用,可能在创伤性脑损伤的诊断治疗中作为潜在的分子靶点,为新的临床诊治方法提供思路。