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目的明确TLR4在RA调控RARβ促进紧密连接蛋白ZO-2表达过程中的作用。方法1.体外:RA处理Caco-2细胞后,ELISA检测培养液中zonulin的浓度;激光共聚焦结果检测RARβ、TLR4和ZO-2在Caco-2细胞中的共定位;Real-time PCR和Western blotting检测Lv-siTLR4感染的Caco-2稳定细胞株中RARβ、ZO-2 mRNA和蛋白表达水平变化。2.体内:针对野生型和TLR4 knockout小鼠分别构建7周大VA正常(VAN)和VA缺乏(VAD)小鼠模型,高效液相色谱法(HPLC)检测各组小鼠血清视黄酸水平;Ussing chamber检测其结肠组织跨上皮电阻(TER)的变化;Real time PCR和Western blot检测结肠粘膜层RARβ、TLR4和ZO-2 mRNA和蛋白表达水平变化;透射电镜(TEM)观察各组结肠上皮细胞间紧密连接结构改变。结果1.RA处理后,Caco-2细胞培养液中zonulin的浓度明显降低(P=0.043)。激光共聚焦观察到Caco-2细胞中RARβ和TLR4在核周和细胞膜上具有共定位表达,TLR4和ZO-2共表达于细胞膜上,而RARβ和ZO-2在Caco-2细胞上几乎没有共定位表达。Lv-siTLR4感染Caco-2稳定细胞株经RA处理后,尽管RARβmRNA和蛋白表达水平显著增加,但ZO-2的mRNA和蛋白表达水平均随TLR4的阻断而显著降低。2.VA缺乏的7周龄野生型(WT)和TLR4 knockout(TLR4KO)小鼠血清视黄醇水平均显著低于VA正常小鼠(P<0.0001,P=0.009)。WT小鼠中VAD组的TER显著低于VAN组(P=0.002),而TLR4KO小鼠中VAD组和VAN组TER并无统计学差异。进一步分析发现,WT小鼠中VAD组结肠粘膜层中的RARβ、TLR4和ZO-2 mRNA和蛋白表达水平均较VAN组显著降低,TLR4KO小鼠中VAD组结肠粘膜层中的RARβmRNA和蛋白表达水平均较VAN组显著降低,但ZO-2的表达水平却与VAN组无显著差异。透射电镜观察发现,VAN WT小鼠结肠上皮细胞间紧密连接结构致密、完整,VAD WT的紧密连接结构疏松、不完整;而TLR4KO小鼠中VAN与VAD两组间的紧密连接结构无明显差异。结论当RA激活RARβ信号通路时,siTLR4可下调肠上皮细胞间的ZO-2表达水平;而VA不同营养水平并不影响TLR4KO小鼠肠上皮屏障功能。TLR4在RA诱导RARβ,促进ZO-2表达水平,增强肠上皮屏障功能中发挥重要作用。