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鸡毒支原体(Mycoplasma Gallisepticum,MG)属于支原体目、支原体科、支原体属,是禽类重要病原体之一。鸡毒支原体可感染鸡、鸭、鹅、鸽、鹌鹑、火鸡、家雀等多种禽类,主要表现为呼吸道症状。鸡群感染鸡毒支原体后除表现咳嗽、流鼻涕、流泪、哕音、呼吸困难等症状外,还可导致蛋鸡产蛋率下降,种蛋孵化率降低,肉鸡生长发育受阻,饲料转化率降低。该病发病率极高,几乎100%的鸡场都有此病,鸡场一旦感染就很难彻底清除,给养禽业带来巨大的损失。并且,鸡毒支原体的感染可使鸡群对其它病原微生物如大肠杆菌、禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒等的易感性增加,导致混合或继发感染,引起更为严重的呼吸道综合征,从而使损失加剧。丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase)是丙酮酸脱氢酶复合体的其中的一个酶,是关键的限速酶。已经有研究表明,支原体参与代谢的酶类如烯醇化酶(enolase),甘油醛-3一磷酸脱氢酶(GAPDH),丙酮酸激酶(pyruvate kinase, PK),除了自身的催化功能外,还可以作为毒力因子参与致病的作用。目前在鸡毒支原体中的的丙酮酸脱氢酶的功能尚不清楚,本文将开展其生物学功能研究。另外本研究成功构建了鸡毒支原体随机插入转座载体,利用该载体进行了随机突变,建立了随机突变库。1.丙酮酸脱氢酶的生物学功能研究根据GenBank中鸡毒支原体Rlow株的序列分别设计两对引物,通过PCR方法获得了鸡毒支原体丙酮酸脱氢酶α亚基和β亚基的基因。将其克隆至pGEM-T easy,测序并完成点突变后,将pdha和pdhb分别克隆至pET28a(+)载体,构建重组表达质粒pET-pdha和pET-pdhb。分别将其转化至大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下成功获得表达融合蛋白His-PDHA和His-PDHB,大小分别为34kDa和41kDa。纯化蛋白后对其进行酶活性检测,结果显示该酶的单个亚基不具有酶活性,将两种酶混合后再体外具有催化功能,活性稍低于标准品。将纯化后的表达产物(His-PDHA和His-PDHB)免疫小鼠制备了PDHA和PDHB抗血清,并通过Western-blot和ELISA验证了表达蛋白的免疫原性。Western-blot显示PDHA和PDHB多抗血清可与提取的鸡毒支原体膜蛋白发生特异性结合；说明鸡毒支原体膜表面有PDHA和PDHB。同时展示在大肠杆菌膜表面的PDHA和PDHB的重组菌株可以黏附禽DF1细胞。细胞黏附试验表明His-PDHA和His-PDHB鼠多抗对DF1细胞的黏附阻断率为30.8%和45%。补体杀菌试验结果表明His-PDHB和His-PDHB多抗血清具有良好的杀菌作用。2.鸡毒支原体随机转座突变载体的构建为研究鸡毒支原体中重要蛋白与毒力的关系。本研究拟构建mini-Tn4001SpGm随机转座插入载体。该转座子具备以下特征：含庆大霉素抗性基因,由螺原体螺旋启动子启动抗性基因的表达；抗性基因两侧为含Inner和Outer的IS256插入重复区；重复区之外为金黄色葡萄球菌转座酶基因。通过对随机缺失株的抗性筛选和基因组PCR方法检测,成功获得了738株随机缺失株。Southern blot验证抗性基因在支原体基因中随机插入。运用测序方法,最终确定了插入位点。这一转座子载体的成功构建为发现鸡毒支原体毒力相关蛋白奠定了基础,对下一步在鸡毒支原体中插入外源基因表达异源蛋白提供了有效的基因操作工具.