论文部分内容阅读
目的：将外源性人端粒酶逆转录酶(hTERT)导入到新西兰大白兔第二代关节软骨细胞,探讨该基因能否激活兔关节软骨细胞的端粒酶活性并延长细胞在体外培养的寿命,并为以后的永生化兔关节软骨细胞系的建立奠定基础。方法：1.用脂质体方法将质粒pLEGFP-Cl-hTERT分别稳转和瞬转PT67包装细胞,收集病毒上清液,并用NIH3T3细胞测定病毒上清液的病毒滴度；2.第二代兔关节软骨细胞分别被上述两种逆转录病毒上清液感染后,经G418药物压力筛选获得克隆细胞并扩增,从而初步建立永生化兔关节软骨细胞；3.用RT-PCR方法检测永生化兔关节软骨细胞中的hTERT-mRNA表达,并与第二代的兔关节软骨细胞相比较。结果：1.质粒稳转包装细胞后经G418筛选后获得了稳定产毒的抗性细胞株,通过RT-PCR检测抗性克隆株(PT67-hTERT)中的hTERT-mRNA表达,并和正常PT67细胞相对照。检测结果发现在抗性克隆株PT67和正常PT67细胞中均可见一条扩增带,但抗性克隆株PT67的条带明显强于正常组PT67(p<0.05)。说明hTERT-mRNA在正常的PT67细胞株中就有转录,但其外源性的hTERT基因使其转录明显增强。并测得稳转后病毒的滴度为2.0×105CFU／ml；瞬转包装细胞产生的病毒上清液的病毒滴度为1.0×106CFU／ml。2.经流式细胞仪检测,稳转包装细胞产生的病毒上清液感染兔第二代关节软骨细胞的感染率是28.55±6.99%,瞬转包装细胞产生的病毒上清液感染兔第二代关节软骨细胞的感染率是81.42±11.45%。未感染的兔第二代关节软骨细胞做为空白对照,其感染率为0.23±0.05%。通过方差分析p<0.05,认为两种病毒感染方法有显著性差异。3RT-PCR检测永生化兔关节软骨细胞的hTERT-mRNA表达时,可见145bp的特异性电泳带,而未感染的第二代兔关节软骨细胞却未见条带,说明hTERT基因被成功导入到第二代兔关节软细胞中并被表达。结论：1.成功构建了表达hTERT基因片段的逆转录病毒。2.将质粒pLEGFP-C1-hTERT分别稳转和瞬转PT67包装细胞后获得的病毒上清液感染第二代兔关节软骨细胞,经流式细胞仪检测后认为瞬转方法获得病毒感染率高。3.在逆转录载体的介导下将外源性hTERT基因导入兔关节软骨细胞,可激活兔关节软骨细胞的端粒酶活性。