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毒素-抗毒素系统广泛存在于原核生物体内,通过系统中一对共表达的基因产物相互作用参与介导外界环境胁迫条件下细胞生长抑制或死亡的生理活动。目前,只是对于大肠杆菌染色体上毒素-抗毒素系统mazEF和relBE研究相对深入,仅有少量的实验报导进行蓝细菌染色体TA系统的研究。本实验是首次对鱼腥藻PCC7120体内的TA系统同源基因进行探索研究,在生物信息学理论分析的基础上,借助双启动子表达载体可单独和同时诱导表达的特性,分别控制预测的毒素基因和抗毒素基因表达,分析对细胞生长影响,从而鉴定出目的基因的毒素-抗毒素作用;并且通过基因敲除原理构建缺失突变株,确定目的基因在鱼腥藻PCC7120体内生理调节功能。主要包括以下几方面内容: 1)根据细菌染色体上TA系统基因的遗传结构特征,保守序列、编码产物同源性及蛋白等电点等理化性质预测和结构域等二级结构预测初步确定鱼腥藻PCC7120染色体上两对基因:all3211/asl3212为mazEF毒素-抗毒素系统同源基因,asl4561/asl4562为relBE毒素-抗毒素系统同源基因; 2)构建双启动子诱导表达载体,分别将毒素基因 all3211置于 PBAD启动子之下、抗毒素基因asl3212置于Plac启动子之下,诱导表达,鉴定这对mazEF同源基因各自对大肠杆菌细胞的毒素-抗毒素作用:all3211基因在 L-(+)-阿拉伯糖单独诱导下对大肠杆菌细胞产生毒性,当 L-(+)-阿拉伯糖和 IPTG同时诱导all3211/asl3212基因表达时,可解除all3211表达产物对对大肠杆菌细胞的毒性,证明all3211和asl3212构成一对毒素-抗毒素系统,all3211为毒素基因,asl3212为抗毒素基因; 3)构建重组表达质粒pET28a-asl4561和pET28a-asl4562,在大肠杆菌中诱导 asl4561和 asl4562表达,鉴定这一对 relBE同源基因的生理功能,并对asl4561-asl4562合基因蛋白表达条件进行优化,结果表明:IPTG诱导 asl4561表达产物对大肠杆菌有抑制作用,说明asl4561编码蛋白产物作用于大肠杆菌生命调节系统,造成损害;两基因共表达时,对大肠杆菌毒性作用减少,说明两基因的表达产物发生相互作用,解除 asl4561表达产物对大肠杆菌的毒性;asl4561-asl4562合基因最佳诱导表达条件为 IPTG浓度0.8 mM、Kan浓度100μg/mL、在接种后培养1-1.5 h后加入诱导剂,28℃诱导6 h; 4)用 Kan抗性片段代替 all3211-asl3212或 asl4561-asl4562基因对构建的all3211-asl3212或asl4561-asl4562基因缺失突变株,在常规培养条件下构建的鱼腥藻缺失突变株生长正常,没有显著影响细胞生理功能,为进一步深入确定这两对基因功能机理奠定基础; 5)根据之前在大肠杆菌中实验结果,将毒素基因和合基因置于铜离子结合蛋白启动子 PPetE之下,构建铜离子诱导表达载体,转化鱼腥藻 PCC7120 all3211-asl3212和 asl4561-asl4562基因对缺失突变株,铜离子诱导 all3211、asl4561表达产物对鱼腥藻 PCC7120细胞具有毒性作用,当铜离子诱导all3211/asl3212、asl4561/asl4562共表达时,毒素蛋白对鱼腥藻PCC7120细胞的毒性作用被抑制。并且在不同铜离子浓度培养条件下,随着铜离子浓度加大,诱导毒素蛋白表达的突变株生长量相应减少,说明毒素蛋白导致大部分藻细胞死亡,一部分藻细胞生长受抑制。根据上述结果在鱼腥藻PCC7120体内all3211、asl4561基因为毒素基因,上游的 asl3212、asl4562基因为抗毒素基因, all3211/asl3212、asl4561/asl4562这两对基因各自构成鱼腥藻PCC7120染色体上毒素-抗毒素系统基因。