研究背景肺癌是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,导致肺癌患者死亡的主要原因是肿瘤转移。其中,非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)约占所有肺癌发病率的80-85%左右。NSCLC的发生和进展是一个多基因参与、极其复杂的病变过程,而且肺癌起病隐匿,大多数肺癌患者就诊时已近晚期、预后较差,因此,解析促进NSCLC迁移、侵袭进程的关键节点分子对于其早期诊断治疗至关重要。近年来发现,多种重要的免疫调节分子PD-L1、B7-H3、B7-H4、B7-H6、TIM-3等在NSCLC中异常高表达,并与其预后密切相关,现已成为NSCLC治疗的重要靶点。白细胞介素6(interleukin-6, IL-6)是目前发现的生物学功能最广的细胞因子之一,参与细胞的生成、增殖和分化,并参与调节免疫反应。IL-6在肿瘤微环境中的作用具有双重性,既可通过促进肿瘤细胞的增殖、生长、转移、血管生成及免疫抑制发挥促肿瘤进展的特性,又可通过调节T细胞增殖、存活、CD8+T细胞向淋巴结及肿瘤迁移发挥抗肿瘤特性,表明IL-6在肿瘤发生及发展中是一个多能性的细胞因子。更多的研究显示,IL-6可通过JAK/STT、Ras/Erk和P13K介导的信号通路,调节肿瘤相关基因表达,在肿瘤细胞生长、血管生成、侵袭转移等过程中发挥重要作用。众多研究表明,NSCLC患者外周循环及肺癌组织中IL-6水平升高,而多种肺癌细胞系中表达水平相对较低,相关机制尚不清楚。现已明确,IL-6可以通过诱导上皮间质转化(Epithelial-MesenchymalTransition,EMT)发挥促进NSCLC迁移与侵袭的功能,并有望成为NSCLC诊断与预后的指标。目前用于治疗NSCLC的IL-6抗体已进入Ⅰ期临床试验阶段。然而IL-6促进NSCLC迁移侵袭的分子机制有待于进一步深入阐明。T-cell immunoglobulin domain and mucin domain 4 (T细胞免疫球蛋白域与黏蛋白域4,TIM-4)主要表达在抗原提呈细胞(antigen presenting cells, APC)表面,在NKT细胞、B1细胞、iNKT细胞表面也有表达,但不表达于T细胞,该分子具有重要的免疫调节功能,对于机体免疫耐受、自身稳态的维持至关重要。TIM-4分子在免疫相关疾病中的作用引起广大学者的高度关注,本实验室前期研究发现TIM-4通过负调控巨噬细胞保护免疫性肝损伤,并发现TIM-4亦参与系统性红斑狼疮、Ⅱ型糖尿病、脓毒性休克的疾病进程,文献报道显示,TIM-4分子与埃博拉病毒、HIV、单纯疱疹病毒感染有关,参与缺血再灌注性肝损伤、皮肤移植排斥反应、哮喘、强直性脊柱炎等多种疾病,相关研究充分表明TIM-4分子的功能具有多样性。在肿瘤微环境中,TIM-4高表达在肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage, TAMs)和肿瘤相关树突状细胞(Tumor related dendritic cells, TADCs),并且可以与AMPKαl相互作用激活自噬介导的肿瘤细胞的降解,减少抗原递呈,继而降低细胞毒性淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)对肿瘤的杀伤作用,参与诱导肿瘤免疫耐受。近几年研究报道及我们实验室前期结果发现,除免疫细胞外,TIM-4在多种肿瘤组织中均有表达,包括DC来源的恶性肿瘤、恶性组织细胞肉瘤、朗格汉斯细胞肉瘤、咽旁脂肪肉瘤、食管癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌等。本实验室前期研究显示,多种肺癌细胞系表达低水平的TIM-4,IL-6等多种炎症因子可诱导TIM-4的表达,而TIM-4在NSCLC组织中的表达水平显著高于癌旁组织,而且NSCLC患者肺癌组织中TIM-4表达水平与其预后呈负相关,机制研究发现,TIM-4可以通过其RGD基序与αvβ3相互作用来促进NSCLC细胞的生长、增殖及细胞周期进展。然而,TIM-4在NSCLC转移中的作用及机制尚未见报道。有趣的是,TIM-4与IL-6在肺癌细胞系及NSCLC肺癌组织中的表达趋势存在一致性,而且IL-6可诱导TIM-4的表达,提示TIM-4可能具有参与IL-6促进肺癌进展的生物学效应。本文进一步确定了IL-6在NSCLC转移中的作用,利用肺癌细胞模型和动物实验,初步研究了TIM-4在IL-6促进NSCLC转移过程中发挥的作用,阐明了TIM-4在NSCLC迁移侵袭中的关键作用,为揭示NSCLC转移的机制提供新的理论学说,并为IL-6在肺癌诊断、治疗中的应用提供确凿的实验依据。第一部分IL-6对NSCLC细胞中TIM-4表达的影响及机制研究研究目的进一步明确IL-6刺激对NSCLC细胞中TIM-4表达的影响,并初步探索其分子机制。方法与结果1.IL-6对NSCLC细胞中TIM-4表达的影响利用0、10、50、100ng/ml的IL-6分别刺激A549和NCI-H1975细胞,刺激6h后,利用RT-PCR检测TIM-4 mRNA的表达,利用50ng/ml IL-6刺激A549和NCI-H1975细胞,分别刺激0、6、12、24h后,以Western blot检测TIM-4蛋白的表达,利用50ng/ml IL-6刺激A549细胞,24h后利用免疫荧光检测TIM-4蛋白的表达。结果显示,IL-6可呈剂量、时间依赖性诱导TIM-4 mRNA,蛋白的表达,其中50ng/ml的IL-6刺激24h可诱导较高水平的TIM-4表达,免疫荧光结果也显示IL-6刺激后TIM-4表达上调,并且TIM-4在胞膜、胞浆都有表达。2.IL-6通过NF-κB信号通路诱导TIM-4的表达利用50ng/ml的IL-6刺激A549细胞24h后利用Western blot检测TIM-4蛋白的表达及NF-κB、Stat3信号通路的活化情况,结果发现IL-6刺激后TIM-4表达上调,同时可检测到P65及Stat3的磷酸化。为明确IL-6诱导TIM-4表达的分子机制,分别加入NF-κB或Stat3抑制剂1h后,再利用IL-6刺激24h,结果显示NF-κB抑制剂可以部分逆转IL-6诱导的TIM-4表达量的上调,而Stat3抑制剂则无明显效果,提示IL-6可能通过NF-κB通路诱导TIM-4的表达。结论IL-6通过NF-κB通路诱导肺癌细胞中TIM-4的表达。第二部分 TIM-4促进NSCLC迁移侵袭的作用及机制研究目的探讨TIM-4在NSCLC迁移侵袭进程中的生物学功能及其作用机制方法与结果1.TIM-4过表达促进NSCLC细胞迁移与侵袭能力利用人TIM-4真核表达载体pcDNA3-TIM-4及其对照空载体pcDNA3,分别以脂质体转染A549和NCI-H1975两种肺癌细胞系,转染后24h或48h通过划痕愈合实验检测TIM-4过表达对肺癌细胞迁移能力的影响。结果显示：在两种肺癌细胞中,TIM-4过表达组肺癌细胞迁移细胞数均显著高于对照组(P<0.05)。利用肺癌细胞系A549转染pcDNA3-TIM-4及对照质粒DNA,构建TIM-4过表达的肺癌细胞模型。转染后48h,利用Transwell实验检测了TIM-4过表达对A549细胞迁移和侵袭的影响。结果显示：TIM-4过表达的A549细胞迁移、侵袭细胞数均显著高于对照组。以上结果提示,TIM-4在NSCLC细胞的迁移侵袭过程中发挥重要作用。2.TIM-4在体内促进非小细胞肺癌的转移构建luci-TIM-4过表达的A549细胞模型,用双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性,用Western blot检测TIM-4蛋白的表达水平。结果表明,对照载体与luci-TIM-4转染组均检测到较强的荧光素酶活性,luci-TIM-4组可检测到较高水平的TIM-4蛋白表达,表明Luci-TIM-4过表达细胞模型构建成功。利用G418筛选稳定表达TIM-4的肺癌细胞(A549-luci-TIM-4)和对照肺癌细胞(A549-luci),建立两种稳筛细胞系。将上述细胞,通过尾静脉注射入BALB/c裸鼠体内,建立非小细胞肺癌转移的小鼠模型,活体成像系统检测肺癌细胞转移情况。结果表明,于建模8W时A549-luci组小鼠荧光主要集中于肺部,而A549-luci-TIM-4组小鼠除肺部外下腹部也可检测到荧光信号,表明TIM-4过表达可促进肺癌细胞在体内转移的能力。3.TIM-4过表达对NSCLC细胞EMT的影响将人TIM-4真核表达载体pcDNA3-TIM-4及其对照空载体pcDNA3,分别利用脂质体分别转染A549和NCI-H1975两种肺癌细胞系,转染后48h用qPCR的方法检测肺癌细胞中EMT相关分子(E-cadherin、N-cadherin、Slug 和 Vimentin)及TIM-4 mRNA的表达,Western blot方法检测肺癌细胞中EMT相关分子及TIM-4蛋白的表达。结果显示：在两种肺癌细胞系中,TIM-4的表达水平升高,则间质细胞标志分子N-cadherin与Vimentin的表达和转录因子Slug的表达上调,而上皮细胞标志分子E-cadherin的表达降低,表明TIM-4过表达可促进肺癌细胞EMT进程。4.TIM-4促进NSCLC细胞的EMT部分依赖N-糖基化利用点突变试剂盒构建TIM-4 N-糖基化位点突变质粒pcDNA3-TIM-4(N291Q)双酶切电泳及测序验证质粒的正确性,Western blot检测N-糖基化位点突变对TIM-4蛋白表达的影响。双酶切电泳结果显示,条带位置与预测一致,测序结果显示于291位氨基酸成功将N突变为Q。Western blot结果显示野生型TIM-4蛋白条带与N-糖基化位点突变的TIM-4(N291Q)蛋白位置出现差异,提示糖基化修饰可能影响TIM-4蛋白的分子量。利用野生型人TIM-4真核表达载体pcDNA3-TIM-4、N-糖基化位点突变载体pcDNA3-TIM-4 (N291Q)及其对照空载体pcDNA3,利用脂质体分别转染A549和NCI-H1975两种肺癌细胞系,转染后48h通过Western blot检测TIM-4及EMT相关分子(E-cadherin、N-cadherin、Slug和Vimentin)的表达。结果显示,在两种肺癌细胞系中,突变型TIM-4(N291Q)与野生型TIM-4转染组都可检测到TIM-4-HA融合蛋白的表达,TIM-4组E-cadherin的表达低于对照与TIM-4(N291Q)组,TIM-4组N-cadherin、Slug和Vimentin的表达均高于对照组与TIM-4(N291Q)组,而对照组与TIM-4 (N291Q)相比无明显差异。结论TIM-4部分依赖N-糖基化诱导NSCLC的EMT进程、促进NSCLC的迁移侵袭。第三部分 TIM-4在IL-6促进NSCLC迁移侵袭中的作用研究目的探讨TIM-4在IL-6促进非小细胞肺癌迁移侵袭过程中发挥的生物学作用。方法与结果1.IL-6促进NSCLC细胞的侵袭及EMT进程为进一步验证IL-6的生物学功能,利用50ng/ml的IL-6刺激A549细胞,24h后Transwell实验检测细胞侵袭能力,利用不同浓度的IL-6(0ng/ml,10ng/ml,50ng/ml,100ng/ml)刺激A549细胞24h后,Western blot检测E-cadherin、N-cadherin的表达水平。结果显示,与文献报道一致,发现IL-6刺激组A549细胞侵袭数量(240±8.3)显著多于对照组(125±8),随着IL-6刺激浓度的升高,E-cadherin表达降低,而N-cadherin表达量逐渐升高。2.TIM-4参与IL-6促进NSCLC细胞的迁移侵袭过程利用携载shTIM-4的慢病毒表达载体分别感染A549和NCI-H1975细胞模型,以50ng/ml的IL-6刺激24h后,通过划痕愈合实验和Transwell的方法检测TIM-4在IL-6诱导肺癌细胞的迁移侵袭进程中的作用。划痕实验结果显示,在两种肺癌细胞系中,在无IL-6刺激的条件下,TIM-4干扰组迁移细胞数显著少于空白对照组；在IL-6刺激的条件下,TIM-4干扰组迁移细胞数显著少于对照组；IL-6刺激后的对照组迁移细胞数显著多于空白对照组(未加IL-6刺激)；IL-6刺激后的TIM-4干扰组迁移细胞数显著多于TIM-4干扰组(未加IL-6刺激)。Transwell实验结果显示,在两种肺癌细胞系中,在无IL-6刺激的条件下,TIM-4干扰组迁移、侵袭细胞数显著少于空白对照组；在IL-6刺激的条件下,TIM-4干扰组迁移、侵袭细胞数显著少于对照组；IL-6刺激后的对照组迁移、侵袭细胞数显著多于空白对照组(未加IL-6刺激)；IL-6刺激后的TIM-4干扰组迁移、侵袭细胞数显著多于TIM-4干扰组(未加IL-6刺激)。3.TIM-4介导IL-6诱导的NSCLC的EMT改变利用携载shTIM-4的慢病毒表达载体及对照分别感染A549细胞,以50ng/ml的IL-6刺激24h后,利用qPCR的方法检测EMT相关分子(E-cadherin、 N-cadherin、Slug和Vimentin)及TIM-4 mRNA的表达。在无IL-6刺激的条件下,TIM-4干扰组TIM-4相对表达量显著低于空白对照组；在IL-6刺激的条件下,TIM-4干扰组TIM-4相对表达量显著低于对照组；IL-6刺激后的对照组TIM-4相对表达量显著高于空白对照组(未加IL-6刺激)；IL-6刺激后的TIM-4干扰组TIM-4相对表达量显著高于TIM-4干扰组。在IL-6未刺激的条件下,TIM-4干扰组上皮细胞标志分子E-cadherin相对表达量显著高于空白对照组；在IL-6刺激的条件下,TIM-4干扰组E-cadherin相对表达量显著高于对照组；IL-6刺激后的对照组E-cadherin相对表达量显著低于空白对照组(未加IL-6刺激)；IL-6刺激后的TIM-4干扰组E-cadherin相对表达量显著低于TIM-4干扰组。在IL-6未刺激的条件下,TIM-4干扰组间质细胞细胞标志分子N-cadherin、 Vimentin、Slug的相对表达量显著低于空白对照组；在IL-6刺激的条件下,TIM-4干扰组N-cadherin、Vimentin、Slug相对表达量显著低于对照组；IL-6刺激后的对照组N-cadherin、Vimentin、Slug相对表达量显著高于空白对照组(未加IL-6刺激)；IL-6刺激后的TIM-4干扰组N-cadherin、Vimentin、Slug相对表达量显著高于TIM-4干扰组。结论TIM-4参与IL-6介导EMT进程及促进NSCLC迁移及侵袭过程。创新点及意义本文发现IL-6可能通过NF-kB途径诱导TIM-4的表达,揭示了免疫调节分子TIM-4在IL-6促进NSCLC迁移侵袭中的关键作用,明确TIM-4促进NSCLC细胞EMT及迁移侵袭的生物学效应,初步发现该作用与其N-糖基化有关。通过本研究进一步明确了IL-6促进肺癌迁移侵袭的分子机制,拓宽了对TIM-4促进肺癌进展的生物学特性的认识,为其应用提供理论及实验依据。