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目的:糖尿病肾病是糖尿病患者的严重并发症,可危及病人的生命。有许多因素涉及到糖尿病肾病的发生,如高血糖、炎症因子、氧化应激等。高糖可影响细胞的正常代谢和生理功能。有研究报道,糖尿病高糖环境可诱导肾小管上皮细胞甘油三酯的积聚,进而影响细胞的功能甚至发生间质纤维化,然而,确切的机制还不清楚。ADRP是脂滴形成的敏感标记物,在很小的脂滴形成时,即可检测出ADRP的表达。PI3K/Akt通路是一个多功能的通路,影响细胞的增殖、凋亡和代谢。本研究通过对高糖刺激的人肾小管上皮细胞中ADRP、phospho-Akt和Akt蛋白表达的检测,初步探讨PI3K/Akt通路与糖尿病肾小管上皮细胞脂质沉积的关系。
方法:
1.人肾小管上皮细胞由解放军301医院陈香美教授赠送。细胞分组:正常糖组(glucose5mmol/L)、高糖组(glucose30mmol/L)和LY294002处理组(LY294002+glucose30mmol/L)。
2.应用免疫细胞化学(immunocytochemistry,ICC)方法检测高糖刺激下人肾小管上皮细胞中ADRP蛋白的表达。
3.应用免疫蛋白印迹(Western Blot)检测phospho-Akt和Akt蛋白的表达。
4.油红O染色法检测人肾小管上皮细胞中脂滴。
结果:
1.ADRP在高糖刺激的人肾小管上皮细胞中的表达
采用免疫细胞化学技术检测ADRP蛋白在高糖刺激的人肾小管上皮细胞中的表达,结果显示ADRP在人肾小管上皮细胞表达于细胞浆;相比正常糖组的细胞,高糖刺激下的HKC细胞ADRP表达明显增强,呈棕黄色颗粒状着色,经分析差异有统计学意义,P＜0.05。而经LY294002处理后HKC细胞ADRP表达明显减少。
2.phospho-Akt和Akt在高糖刺激的人肾小管上皮细胞中的表达
Western blot检测显示正常糖组和高糖组HKC细胞总Akt表达未见显著差异,定量分析分别为0.99±0.04和0.99±0.03;激活状态的Akt,即磷酸化Akt在两组间的表达不同,高糖组明显高于正常糖组,分别为0.36±0.05和0.99±0.07,差异有统计学意义。LY294002是PI3K/Akt通路的特异性抑制剂,有效地减少了HKC细胞磷酸化Akt的表达,而对总Akt未见明显影响。
3.高糖诱导人肾小管上皮细胞脂质合成增多
油红O染色显示高糖刺激的HKC细胞胞浆内出现红染的细小颗粒,而正常糖组细胞内未见着色颗粒。经LY294002处理后脂滴形成明显减少。
结论:
1.高糖可诱导人肾小管上皮细胞脂滴标记物ADRP的明显表达,提示糖尿病环境下,高糖是引起肾小管上皮细胞脂质代谢异常的重要因素。
2.高糖可同时上调磷酸化Akt和ADRP表达,而抑制PI3K/Akt通路可有效减少ADRP表达和细胞内脂滴,提示PI3K/Akt通路可能参与了高糖刺激下的人肾小管上皮细胞的脂质代谢。