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酪蛋白磷酸肽是以酪蛋白为底物,经酶水解获得的含有核心结构磷酸丝氨酸基团的并具有促进钙吸收的活性多肽。酪蛋白磷酸肽作为钙补充剂可以应用到婴儿奶粉、保健食品和特殊医学用途配方食品中,具有很好的应用前景。本论文选用牛乳源酪蛋白磷酸肽为研究对象,筛选最佳产地牛乳酪蛋白原料产地、最佳酶制剂,采用单因素考察酶解主要因素,正交优化酪蛋白磷酸肽制备条件。建立活性评价方法,将酪蛋白磷酸肽系统地从水解物中分离纯化出来,运用多种方法对其结构解析。建立体外细胞模型Caco-2细胞单层模型,利用此模型评价酪蛋白磷酸肽单体对钙、镁转运活性的影响。建立SD大鼠模型,考察酪蛋白磷酸肽在动物体内对钙吸收代谢的影响。考察矿物镁因素,酪蛋白磷酸肽在动物体内对钙吸收代谢的影响。研究内容及结果如下:（1）酪蛋白磷酸肽酶解条件优化以酪蛋白为研究对象,以酪蛋白磷酸肽产率为指标,筛选荷兰、法国、美国、新西兰产地酪蛋白原料,筛选碱性蛋白酶、LC蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶,结果显示新西兰产地的酪蛋白以及胰蛋白酶为最佳的底物和酶。考察了酶解pH、酶解温度、底物浓度、酶解时间、酶用量对酪蛋白磷酸肽含量的影响,并用单因素正交试验优化酶解条件。最佳酶解条件为:底物浓度10%、酶解pH 8.0、温度50℃、酶解2 h。为提高酪蛋白磷酸肽醇沉得率,考察了pH、CaCl2添加量、乙醇浓度、温度、沉淀时间对酪蛋白磷酸肽得率的影响,最佳醇沉条件为:pH5.5、CaCl2添加量0.6%、乙醇终浓度50%、温度5℃、沉淀时间6 h。（2）酪蛋白磷酸肽的分离纯化及结构解析以体外钙螯合能力为筛选酪蛋白磷酸肽指标,采用活性追踪法利用制备、分析高效液相色谱从酪蛋白水解物中分离纯化酪蛋白磷酸肽单体（P1、P2、P3、P4、P5）。经MALDI-TOF-MS、高分辨多级质谱、氨基酸测序仪分析,P1分子量2061.69 Da,由18个氨基酸组成,序列为FQpSEEQQQTEDELQDK,属于酪蛋白β（48-63）,P2分子量2043.64 Da,由18个氨基酸组成,序列为FQpSEEQQQTEDELQDK-NL18,属于酪蛋白β（48-63）,P3分子量1927.53 Da,由16个氨基酸组成,序列为DIGpSEpSTEDQAMEDIK,属于酪蛋白αs1（58-73）,P4分子量1951.83 Da,由16个氨基酸组成,序列为YKVPQLEIVPNpSAEER,属于酪蛋白αs1（119-134）,P5分子量1890.74 Da,由25个氨基酸组成,序列为RELEELNVPGEIVEpSLpSpSpSEESITR,属于酪蛋白β（16-40）。化学合成单体P1、P3、P4、P5。利用RP-HPLC、红外光谱、圆二色对比天然与合成单体的结构差异。RP-HPLC结果显示单体P3、P4的保留时间一致,合成单体的紫外吸收显著高于天然单体。红外光谱结果表明天然与合成单体P3、P4均含有α-螺旋、β-转角、β-折叠、无规卷曲特征结构。圆二色结果分析表明天然与合成CPP单体P3、P4的α-螺旋和β-转角比例较低,主要以β-折叠和无规卷曲形式存在,当浓度从2mg/ml上升到4 mg/mL时,二级结构结构由α-螺旋、β-转角向β-折叠-反平行式转变。（3）酪蛋白磷酸肽理化性质利用国标测定CPP1（最佳酶解工艺得到CPP混合物）、CPP2（市售CPP混合物）纯度及化学组成,结果表明市售CPP2的纯度显著高于CPP1。RP-HPLC色谱图分析说明,CPP1和CPP2的成分复杂,与CPP1相比,CPP2的极性较强部分的含量相对较少。松密度、轻敲密度、Hausner比值、Carr’s指数、休止角结果表明,CPP2的流动性优于CPP1。溶解指数表明,CPP1在30%乙醇溶剂中的溶解度极显著高于CPP2。（4）酪蛋白磷酸肽在Caco-2细胞单层模型中的钙、镁转运活性建立Caco-2细胞单层模型,测定不同转运时间点细胞透过液中钙、镁离子转运量。酪蛋白磷酸肽活性单体在Caco-2细胞模型对钙转运的影响:与空白对照组相比,酪蛋白磷酸肽混合物和单体（P1、P2、P3、P4、P5）均显著增加钙转运量,单体的钙转运量显著高于酪蛋白磷酸肽混合物,其中P5的钙转运效果最好。酪蛋白磷酸肽活性单体在Caco-2细胞模型对镁转运的影响:镁转运结果与钙转运结果有相同趋势,酪蛋白磷酸肽混合物和单体（P1、P2、P3、P4、P5）均显著增加镁转运量,单体的镁转运量显著高于酪蛋白磷酸肽混合物,其中P5的镁转运量最大。在镁离子存在的条件下,考察酪蛋白磷酸肽活性单体在Caco-2细胞模型对钙转运的影响:酪蛋白磷酸肽混合物和单体（P1、P2、P3、P4、P5）显著增加镁转运量,单体P5效果最为明显;单体（P1、P2、P3、P4、P5）并没有增加钙转运量,钙转运量甚至低于空白对照组。（5）酪蛋白磷酸肽在大鼠体内对钙吸收代谢的影响设置空白对照组、CaCO3组、P5单体组,考察P5在动物体内对钙吸收代谢的影响。正常SD大鼠饲喂P5后,可以显著增加血清钙水平、股骨长度和股骨钙含量,显著降低血清碱性磷酸酶和尿液吡啶啉含量,上述指标优于空白对照组,其中尿液吡啶啉和股骨钙含量指标优于CaCO3组。大鼠的最终体重、增重以及脏器指数没有显著改变,无任何不良生理现象,不影响大鼠的正常生长、无副作用。调节饲料中镁的剂量,在饲料中镁缺乏或镁充足的情况下,考察酪蛋白磷酸肽在动物体内对钙吸收代谢的影响。设置空白对照组、缺镁组、补镁组、高补镁组、补CPP组、补镁CPP组、高补镁CPP组,分析体重、股骨理化特性、血清生化、尿液生化等与骨代谢相关指标,考察镁的缺乏、镁的补充、添加镁的情况下CPP在动物体内对钙吸收代谢的影响。镁的缺乏导致骨的形成速率降低,促进骨的重吸收。与缺镁组相比,饲料中补充镁或补充CPP可以促进骨的形成,预防骨的重吸收。在镁的影响下,CPP显著增加股骨骨密度、血清骨钙素含量,其中在抑制血清甲状旁腺激素含量、降低尿液脱氧吡啶啉含量和增加股骨长度指标三方面具有协同作用,结果表明,在镁的影响下,CPP更加有利于骨的生长以及抑制骨的重吸收。（6）酪蛋白磷酸肽促钙吸收机理钙离子在小肠中的吸收途径有两种,一种是跨细胞途径的主动吸收,一种是细胞旁路的被动吸收。通过蛋白质印迹法检测与跨细胞途径主动吸收相关的钙通道蛋白TRPV6表达量,监测与细胞旁路被动吸收相关的跨膜电阻值,从而研究P5促进钙吸收的途径。在Caco-2细胞单层模型钙转运期间,CPP单体P5组的跨膜电阻值与空白对照组无显著差异,P5没有通过刺激细胞旁路途径促进钙离子吸收。经P5处理后的Caco-2中钙通道蛋白TRPV6表达显著上调,结果说明P5通过刺激主动跨细胞途径促进钙离子吸收。