论文部分内容阅读
研究背景：葡萄膜炎是一类严重威胁视力的眼病,Behcet病(BD)和Vogt-小柳原田综合征(VKH syndrome)是葡萄膜炎中两种常见的疾病类型。BD目前认为是一种慢性炎症性疾病,常累及全身多个器官。临床主要表现为反复发作的口腔溃疡及生殖器溃疡、非肉芽肿性葡萄膜炎、结节性红斑、皮肤损害等。VKH综合征是一种自身免疫性疾病,常伴有全身多系统受累。双侧肉芽肿性葡萄膜炎是眼部的主要表现,眼外常表现为头痛、脱发、毛发变白、听力下降、白癜风等。补体系统已被证实在固有免疫和适应性免疫中都发挥着重要作用。补体激活途径包括以下三种：经典途径、旁路途经和MBL途径。共同路径是C3激活、C5裂解,启动级联反应,形成攻膜复合物(MAC),诱导组织炎症反应的发生,造成组织细胞的损伤,参与自身免疫性疾病或自身炎症性疾病的发生发展。近年来研究显示补体系统参与了实验诱导性葡萄膜炎(EAU)的发生发展,但补体C3,C5-C9基因拷贝数变异及基因多态与BD和VKH综合征是否相关尚未见报道。因此我们对补体C3,C5-C9基因拷贝数变异及基因多态在BD和VKH综合征里进行遗传易感性研究。第一部分补体基因拷贝数变异在Behcet病、VKH综合征中的遗传易感性研究目的：既往研究证实补体参与了多种自身免疫性疾病的发生发展。本次研究探讨补体C3,C5,C6,C7,C8A,C8B和C9的基因拷贝数变异与BD、VKH综合征的遗传相关性。方法：实验分为2个阶段,第一阶段包括382例BD患者、383例VKH综合征患者和573例正常对照。第二阶段包括682例BD患者、676例VKH综合征患者和1601例正常对照。实时荧光定量PCR (RT-PCR)检测基因拷贝数和mRNA的表达。分层分析基因拷贝数变异与BD和VKH综合征主要临床症状的关系。ELISA检测正常人不同基因拷贝数分型后外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)培养上清中细胞因子IL-17,IFN-γ,IL-10,IL-8,TNF-α,IL-6,IL-1β和MCP-1的水平。结果：补体C3基因拷贝数大于2的频率在BD患者、VKH综合征患者和正常对照组之间于第一阶段存在统计学差异(Pc=5.5×10-,OR=3.4,95%CI=1.7-6.8；Pc=0.018,OR=3.1,95%CI=1.5-6.3)；C5基因拷贝数大于2的频率在BD患者和对照组之间在第一阶段存在统计学差异(Pc=3.3×10-4,OR=7.7,95% CI=2.2-26.9)。第二阶段独立大样本验证,发现C3基因拷贝数大于2的频率在病例组(BD、VKH综合征)和正常对照组之间比较得到与第一阶段类似的结果,两阶段结果合并在一起联合分析后发现C3在BD患者、VKH综合征患者中基因拷贝数大于2的频率比正常对照组显著升高,统计学差异显著(Pc=5.3×10-9,OR=3.0,95% CI=2.1-4.3；Pc=6.4×10-8,OR=2.8,95%CI=1.9-4.1)。C5基因拷贝数变异在第二阶段得到与第一阶段类似的结果,两个阶段结果合并后统计学差异明显,C5在BD患者中基因拷贝数大于2的频率比正常对照组明显升高(Pc=1.1×10-,OR=3.4,95%CI=2.2-5.1)。补体C3,C5基因拷贝数大于2的正常人PBMC表达的mRNA分别依次高于各自基因拷贝数等于2和小于2的mRNA表达(Pc=0.015,Pc=0.018；Pc=0.039,Pc=0.0006)。正常人PBMC根据不同基因拷贝数分型后经LPS或抗-CD3/CD28抗体刺激并培养,收集PBMCs培养上清,检测细胞因子浓度,发现IL-17和IFN-γ在C3拷贝数大于2的正常人PBMCs培养上清中的浓度明显升高,与拷贝数等于2或小于2比较,存在统计学差异(Pc=0.01,Pc=0.001；Pc=0.003,Pc=0.002)；IL-17在C5拷贝数大于2的正常人PBMCs培养上清中的浓度升高,与拷贝数等于2或小于2比较,存在统计学差异(Pc=0.002,Pc=0.0002)。结论：本研究证明补体C3基因拷贝数变异与BD、VKH综合征相关,补体C5基因拷贝数变异与BD相关。第二部分 补体基因多态在Behcet病、VKH综合征中的遗传易感性研究目的：研究补体C3,C5基因多态与BD、VKH综合征的相关性。方法：实验分为两个阶段,第一阶段包括376例BD患者、373例VKH综合征和562例正常对照；第二阶段包含572例BD患者以及807例正常对照。一共10个SNP(C3：rs408290,rs7951,rs344555,rs2250656,rs432001,rs2241394；C5：rs2269067,rs7040033,rs1017119,rs7027797)参与本次研究。基因多态性分型采用探针(TaqMan分型)或PCR-RFLP方法。病例组和对照组的等位基因频率、基因型频率比较采用卡方检验。RT-PCR检测mRNA的表达。ELISA检测细胞因子IL-17,IFN-γ,IL-10,IL-8,TNF-α,IL-6,IL-1β和MCP-1的水平。结果：C3 rs408290在第一阶段显示GG基因型频率在BD患者和对照组之间存在明显差异(Pc=8.6×10-,OR=2.0,95% CI=1.38-3.10),C3基因另外5个SNP的基因型和等位基因频率在BD患者和对照组之间无统计学差异,C3的6个SNP其基因型和等位基因频率在VKH综合征和正常人之间无统计学差异；在第二阶段,其GG型和CG型的频率在Behcet病患者和对照组间差异明显(Pc=3.7×10-4,OR=2.92,95% CI=1.76-4.83；Pc=1.5×10-3,OR=0.61,95% CI=0.48-0.78)；两阶段结果汇总后分析确认了统计学差异(Pc=1.5×10-7,OR=2.31,95% CI=1.69-3.16；Pc=4.9x10-4,OR=0.68,95%CI=0.57-0.81)。C5 rs2269067的GG基因型频率在第一和第二阶段得到类似的结果,都表现为GG型频率在BD患者明显升高,且有统计学差异,两阶段汇总结果证实rs2269067 GG型频率与正常对照的差异性(Pc=1.3×10-,OR=1.73,95% CI=1.45-2.06),C5另外3个SNP的基因型和等位基因频率在Behcet病患者和正常人之间无统计学差异,C5的4个SNP的基因型和等位基因频率在VKH综合征和正常人之间无统计学差异。C3 rs408290和C5 rs2269067的GG型对应正常人外周血单核细胞的mRNA表达分别与CG型和CC型对应正常人外周血单核细胞中的mRNA表达比较后有统计学差异(Pc=1.5×10-4,Pc=2.5×10-；Pc=0.009,Pc=0.002)。C3 rs408290 GG型对应的正常人PBMCs培养上清中IL-17和IFN-y的表达水平分别与CG型或CC型对应正常人PBMCs培养上清中的细胞因子比较,发现有显著性差异(Pc=8.5×10-5,Pc=2.3×10-5；Pc=0.015,Pc=0.001),其他6种细胞因子表达水平在C3 rs408290三种基因型间无统计学差异。C5 rs2269067的GG型对应正常人外周血单核细胞培养上清中IL-17的表达水平与CG型或CC型对应正常人外周血单核细胞培养上清的IL-17表达水平比较发现有统计学差异(分别为Pc=0.021,Pc=0.006),其他6种细胞因子在C5 rs2269067三种基因型间无统计学差异。结论：本研究证实补体C3、C5基因多态与BD相关。