研究目的1．观察大鼠骨髓基质细胞的体外分离和培养，为移植骨髓基质细胞治疗大鼠脑外伤奠定基础。2．将培养传三代BMSCs尾静脉注射移植脑外伤大鼠体内，观察骨髓基质细胞(BMSCs)能否促进细胞分化，增加脑利钠肽(BNP)表达以及促进脑外伤(TBI)大鼠神经功能的恢复。研究方法1．取60～90g Wistar大鼠，腹腔内注射5-氟尿嘧啶(150 mg／kg)以杀死外周血细胞促进骨髓的再生，3天后处死，密度梯度离心结合贴壁培养法体外培养骨髓基质细胞，利用倒置相差显微镜观察原代及不同传代细胞的生长形态特点，并用流式细胞仪鉴定原代以及不同传代细胞表型。2．第3代骨髓基质细胞移植前3d培养液中加入Brdu(3μg／ml)，继续培养3d，胰酶消化后收集细胞悬液，离心细胞沉淀，PBS悬浮后计算细胞密度，制成终浓度3×10~6／ml，移植备用。3．选取清洁级3月龄Wistar大鼠共72只，随机分为假手术组(n=24)：切开皮肤移除相同大小颅骨，没有受到脑外伤，未作特殊处理；TBI+PBS组(n=24)：在脑外伤后第一天通过尾静脉注射1ml PBS；TBI+BMSCs组(n=24)：在脑外伤后一天通过尾静脉注射1ml PBS，内含BMSCs(3×10~6)。移植前3天细胞培养液内加入BrdU(3μg／ml)用来标记新生细胞。所有实验动物均在实验期间腹腔注射BrdU(50 mg／kg)，每天两次。正常大鼠和脑外伤大鼠，包括BMSCs组和PBS组，在脑外伤前和脑外伤后第3d、7d被处死(每个治疗组每次6只)，留取脑组织，测定BNP mRNA表达。在脑外伤前和脑外伤后第3d、7d采集血液用作放射免疫方法分析，测定血浆BNP浓度(每个治疗组每次6只)。在脑外伤后第15d处死剩余大鼠，将包含损伤临界区(BZ)、脑室下区(SVZ)和海马部位(HZ)的脑组织灌注固定，石蜡切片，厚度为6μm。脑冠状切片应用二氨基联苯胺(DAB)染色免疫组织化学检查测定新生5—溴脱氧尿核苷(BrdU)阳性细胞；为了测定新生细胞是否向神经元方向分化，脑冠状切片进行异硫氰酸荧光素(FITC)和Cy5标记双染色测定神经元标记Tuzil、doublecortin和NeuN。实验期间应用mNSS平分标准在移植前和移植后2d、5d、8d、11d和第15d对动物进行行为学检查，进行神经功能评估。结果1．培养的骨髓基质细胞第3代，骨髓基质细胞的细胞表面标志CD90表达阳性的细胞已占到91.5％±1.87％。造血干细胞的细胞表面标志CD45表达阳性的细胞己从原代的73.3％±2.16％降低到5.8％±1.47％。2．BMSCs显著提高脑外伤大鼠神经功能的恢复。与PBS治疗组相比，mNSS在治疗后的第8天、11天和第15天，BMSCs治疗组大鼠的mNSS显著降低，神经功能缺失得到明显改善。3．治疗后第15d，大鼠同侧大脑半球和对侧大脑半球内BrdU阳性细胞数比较结果：与假手术组对比，在PBS治疗组大鼠的同侧大脑半球和对侧大脑半球的SVZ、HZ BrdU阳性细胞数显著增多(p＜0.05)；与PBS治疗组相比，BMSCs治疗组同侧和对侧SVZ、HZ和BZ区BrdU阳性细胞数显著增多(p＜0.05)。4．与PBS治疗组相比，在BMSCs治疗组的SVZ，BZ及HZ中免疫组化荧光双标记显示出BrdU阳性细胞中表达Tuj 1、doublecortin和NeuN的比例显著升高(p＜0.05)。5．治疗前三组大鼠脑内BNP mRNA无显著差别。在脑外伤后的第3天和第7天，在PBS治疗组和BMSCs治疗组BNP mRNA的表达显著增加(p＜0.05)，而假手术组无明显变化(p＞0.05)。与假手术组相比，PBS治疗组BNP mRNA在脑外伤后的第3天和第7天显著提高(p＜0.05)。与PBS组相比较，在伤后第3天和第7天，BMSCs治疗组大鼠脑内BNP mRNA的表达显著增加(p＜0.05)。6．治疗前大鼠血浆内BNP的浓度三组之无显著差别(p＞0.05)。在第3天和第7天，PBS治疗和BMSCs治疗组BNP的浓度显著增加，而假手术组无明显变化。与假手术组相比，PBS治疗组BNP浓度在脑外伤后的第3天和第7天显著提高(p＜0.05)。与PBS组相比较，在伤后第3天和第7天，BMSCs治疗组大鼠血浆内BNP的浓度显著增加(p＜0.05)。结论1．传3代的骨髓基质细胞可作为理想的细胞移植治疗的细胞来源；2．静脉应用BMSCs能促进脑外伤后大鼠神经细胞的再生和分化，促进神经功能恢复。一些抵抗脑水肿和血管活性因子，如BNP，可能对这种治疗效果的产生起到促进作用。