刺参(Apostichopus japonicus)重要经济性状相关QTL位点的验证分析

来源 :上海海洋大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:jocelynsusan
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刺参属于棘皮动物门(Echinodermata)、海参纲(Holothuroidea),是我国北方重要的海珍品之一。近年来,我国刺参养殖得以长足发展,规模拓展迅猛,直接经济产值约300亿元,是我国海水养殖产业中单一产值最大的物种,为沿海渔业经济结构的调整和渔民就业及增产增收提供了重要途径。随着刺参产业规模的逐渐扩大,种质退化、生长缓慢、养殖周期长、抵御环境变化能力差、病害频发等一系列制约或潜在制约产业发展的瓶颈问题也日益凸显,分子标记辅助育种是解决上述问题的有效手段。随着分子技术的发展,构建遗传连锁图谱,利用与目标性状紧密连锁的分子标记对性状的遗传改良是当今水产动物遗传育种的研究热点。但由于小样本作图QTL区间过大和易受环境影响的原因,导致QTL的检测和对QTL效应评估发生偏离,因此对QTL进行验证是实施MAS的前提。本研究在前期构建的刺参高密度遗传连锁图谱的基础上筛选重要性状相关的QTL位点并进行验证和生产性应用实践,利用SSR对刺参进行亲子鉴定分析,以期为刺参分子标记辅助育种提供基础数据。本文研究结果如下:1.刺参重要经济性状相关SNP标记的筛选实验室前期构建了刺参高密度遗传连锁图谱,该图谱包含4002条SLAF标签。结合构建图谱家系所用子代的性状数据,筛选出与体长、体宽、体重、棘刺总数及抗病力(抗灿烂弧菌侵染)这5个性状相关的9个QTL区域,包含81条SLAF标签。本研究在以上基础上开展性状相关SNP标记筛选,在81个SLAF标签上共获得841个SNP位点,SNP位点与性状相关性分析共获得189个性状相关SNP位点,进一步开展了这些SNP位点基因型与性状相关性分析筛选到具有相关性状优势基因型的SNP位点79个,结合HRM(High resolution melting,HRM)小片段法基因分型引物设计要求获得能用于HRM小片段法基因分型与性状显著相关且不同基因型之间的差异显著性的SNP位点共26个。其中与体长、体宽、体重、棘刺总数和抗病相关的标记分别8、14、9、8、18个(其中15个位点与多个性状相关)。根据所筛选的26个SNP标记的序列信息,成功设计可用于小片段法SNP基因分型的特异性引物14对,对14个SNP位点进行基因分型检测,SNP107在检测群体中有明显的多态性但未分型成功,得到能分型的引物13对。2.重要经济性状相关SNP标记在大规模刺参养殖群体中的验证在扩大繁育群体中利用HRM小片段法对这13个刺参重要经济性状相关的候选SNP位点进行分型和多态性检测并结合扩大群体的相关性状数据进行位点验证。对13个SNP位点进行基因分型和多态性检测结果表明:有3个单态性位点,剩下的10个多态性位点中有3个位点表现低等位多态性,7个位点为中等位多态性。10个多态性位点的最小等位基因频率(MAF)介于0.016(SNP113)0.332(SNP160)之间,平均值为0.173;各位点的观测杂合度(Ho)介于0.031(SNP113)0.818(SNP9)之间,平均值为0.433;期望杂合度(He)介于0.031(SNP113)0.834(SNP9)之间,平均值为0.402;多态信息含量(PIC)介于0.030(SNP113)0.393(SNP160)之间,平均为0.248,有6个位点偏离哈德-温伯格平衡。QTL验证结果表明SNP40和SNP160位点为与生长(体长、体重、体宽)相关的位点,各位点的优势基因型分别为SNP40(CC)和SNP160(AA);SNP88、SNP112和SNP126这3个位点为与抗病力相关,各位点的优势基因型为SNP88(CC)、SNP112(AA)、SNP126(TT)。基于这五个位点构建生长和抗病二倍型,发现S1(CC AA)、S3(CC AC)在生长方面优势显著,二倍型K1(CC AA TT)抗病力最强。3.刺参重要经济性状相关SNP标记在选育生产中的验证利用在大规模养殖刺参群体中验证得到的5个与生长或抗病力相关的SNP位点筛选携带速生或抗病标记的亲本,构建潜在快速生长子代群体(标记为A)、潜在生长速度慢的子代群体(标记为B)、抗病子代群体(标记为C)和易感子代群体(标记为D)。通过追踪保苗期A、B群体苗种生长性状和8月龄C、D群体对灿烂弧菌的耐受性,验证分子标记的选育效果。结果显示采用(CC AA)×(CC AC)基因型构建的A群体其子代苗种各基因型所占数量百分比为74%(CC AA)、26%(CC AC),采用(CT CC)×(CT AC)基因型构建的B群体其子代(CT CC)、(CT AC)、(CC AC)、(CC CC)各基因型的占比分别为32%、20%、10%、32%;A群体苗种在5月龄、6月龄、7月龄、8月龄时期的平均体重比B群体同期子代苗种提高24.32%、65.69%、304.40%、182.07%;采用(CC AA TT)基因型构建的C群体中其基因型全部为(CC AA TT),采用(CT AG TG)构建的D群体,子代5种基因型(CT AG TG)、(CT AG GG)(TT AG TG)、(TT AG GG)、(CT GG TG)在检测个体中所占比例别为15%,15%,11%,9%,12%,高浓度灿烂弧菌人工攻毒感染结果表明C群体的累计存活率比D群体高47.06%。相应结果表明利用相关优势基因型培育的苗种在生长或抗病力方面均获得预期的优势性状。4.微卫星标记在刺参亲子鉴定中的应用与效果评价选取23头亲参(13头雌参和10头雄参)为亲本培育子代苗种,利用实验室前期开发的13对微卫星引物对23个亲本及随机选择的72个子代进行基因分型和亲子关系鉴定。等位基因频率分析显示:13个位点在检测群体中等位基因数共121个,平均等位基因数为9.308,观测杂合度在0.2810.719,平均值为0.564;期望杂合度在0.3160.87,平均0.683;各位点的多态信息含量在0.3040.853,平均0.648,其中9个位点为高等位多态性(PIC≥0.5),4个为中等位多态性(0.25≤PIC≤0.5);位点AJ09显著偏离哈德温伯格平衡,AJ11极显著偏离,无效等位基因在-0.06290.2149;排除率分析结果显示13个SSR位点对子代的累积排除率为0.997、0.999、0.999;模拟分析结果显示68个成功找到候选亲本,鉴定率达94.4%;按照PIC由高到低删除位点,排除率计算结果为已知单亲时需要至少7-9个位点,双亲都已知时至少需要6个位点,按照PIC从低到高计算排除率结果显示:已知单亲时需要3-4个位点,双亲都已知时2-3个位点。总体趋势随着微卫星位点的增加,累积排除率逐渐增大,PIC越高排除率越大;对68个成功鉴定的子代进行位点信息分析表明7个微卫星位点即可完成刺参亲本的亲子鉴定。相关结果将为刺参苗种亲子鉴定或苗种选育管理提供基础数据。
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