α-烯醇化酶是糖酵解途径中的关键酶,催化糖酵解途径中2-磷酸甘油酸(PGA)与磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)之间的转化。除此之外,α-烯醇化酶还具有其他重要功能,例如α-烯醇化酶在细胞纤溶过程中作为纤维溶酶原受体,促进细胞与细胞之间的信息交换;结合c-myc启动子并抑制c-myc表达;α-烯醇化酶还被鉴定为自身抗原诱发自身免疫反应等。近来越来越多的研究发现α-烯醇化酶的瓜氨酸修饰与神经退行性病变及多种自身免疫性疾病(如类风湿性关节炎)发病机制密切相关,因此,迫切需要能结合瓜氨酸化α-烯醇化酶的特异性抗体进一步研究其在相关疾病发生过程中的作用。本研究通过化学合成方法制备瓜氨酸化α-烯醇化酶9R～25F多肽(citrullinatedα-enolasepeptide,CEP)。采取活泼酯法将CEP多肽与BSA偶联制备CEP-BSA偶联抗原并免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术制备CEP单克隆抗体。免疫组织化学检测和免疫印迹分析验证抗体的特异性。研究结果如下:1)通过实验室之前对α-烯醇化酶蛋白序列的生物信息学分析,确定了其免疫显性表位9R～25F。将表位多肽中2个精氨酸替换为瓜氨酸,化学合成瓜氨酸化α-烯醇化酶9R～25F多肽(citrullinated α-enolase peptide,CEP),再采取活泼酯法偶联CEP多肽和BSA,偶联抗原经SDS-PAGE鉴定偶联成功。2)CEP-BSA偶联抗原免疫6周龄BALB/c小鼠,经检测三次免疫后血清抗体效价达到细胞融合要求。PEG介导细胞融合、有限稀释法进行亚克隆筛选,终成功筛选出一株稳定分泌CEP特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为9B5,亚型鉴定该单抗为IgG2b亚型。3)9B5单抗经硫酸铵沉淀联合辛酸沉淀纯化,免疫印迹分析结果显示9B5单抗能特异性结合瓜氨酸化的α-烯醇化酶,而不结合非瓜氨酸化的α-烯醇化酶。免疫组织化学检测显示9B5单抗能结合老龄大鼠脑皮层组织细胞上瓜氨酸化的α-烯醇化酶,而与健康大鼠脑组织细胞内的抗原不发生结合,进一步验证了 9B5单抗能特异性结合瓜氨酸化的α-烯醇化酶。本研究成功制备了一株特异性结合瓜氨酸化α-烯醇化酶的单克隆抗体,该抗体的成功制备将有助于进一步探究瓜氨酸化α-烯醇化酶在相关疾病中的作用。