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目的:基于中药化学生物学理论,以四逆汤中的主要毒-效成分为研究对象,利用斑马鱼模型,结合网络药理学,研究四逆汤组方配伍减毒作用机制。方法:以斑马鱼模型为研究平台,结合传统中医学理论,考察四逆汤代表性成分的毒性作用;研究乌头碱、异甘草素发育毒性及作用机制;以附子中的主要毒性成分为造模药物,筛选干姜、甘草中的减毒成分;利用网络药理学方法研究6-姜酚、甘草酸拮抗乌头碱心脏毒性作用机制。结果:1、附子代表性成分乌头碱、中乌头碱、次乌头碱对斑马鱼均有毒性作用,乌头碱心脏毒性表型最明显。干姜代表性成分6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚对斑马鱼均有毒性作用甘草中的甘草酸、甘草苷、甘草素给药剂量达200μM仍未造成斑马鱼死亡,异甘草素给药至12μM对斑马鱼有明显毒性作用。2、乌头碱给药至72 hpf(受精后72小时)时,7.27μM给药组卵黄囊吸收延迟,8.23μM给药组心包水肿、鱼鳔缺失和体形弯曲。96 hpf时7.27和8.23μM组均观察到心包水肿、鱼鳔缺失、卵黄囊吸收延迟和体形弯曲;8.23μM胚胎死亡率达100%。乌头碱对心脏、肝脏、神经系统发育有明显的毒性。乌头碱给药至96 hpf时,7.27和8.23μM给药组心包水肿率升高,射血分数、每搏输出量、心室短轴缩短率降低,肝脏面积减小,肝脏荧光强度降低,神经节长度变短,总游动距离和游泳速度也显著降低。乌头碱给药组斑马鱼中检测到心脏区域ROS含量升高,体内T-SOD活性降低、MDA含量升高。AO、TUNEL染色显示心肌细胞和脑部细胞发生凋亡。qRT-PCR实验结果表明,JNK、Bax、Bad、Cyto c、Caspase-9、Caspase-3表达升高,Erk1/2、Bcl-2表达降低。氧化应激通路中Nrf2、HO-1、Sod-1、Cat表达降低。自噬相关基因,LC3表达量升高,Beclinl、Atg3表达量呈降低趋势。3、异甘草素给药至96 hpf时,16.31μM给药组畸形率达到100%,12.37和16.31μM给药组体长抑制作用明显。12.37和16.31μM给药组中均观察到心包水肿、鱼鳔缺失、卵黄囊吸收延迟和弯曲体形。异甘草素对心脏、肝脏、神经系统发育具有明显的毒性。异甘草素给药组斑马鱼心脏区域ROS含量升高,体内T-SOD活性降低、MDA含量升高。AO、TUNEL染色显示心肌细胞发生凋亡。组织病理学染色显示肝脏细胞出现裂隙,肠壁细胞的不规则排列,心壁细胞变薄和心肌纤维化。qRT-PCR实验结果表明,JNK、Bad、Cyto c、apaf-1、Caspase-9、Caspase-3表达升高,Bax/Bcl-2表达比率升高,Erk1/2表达降低。Keap-1表达升高,氧化应激通路相关基因Nrf2、HO-1、Sod-1、Sod-2表达降低。4、干姜代表性成分中6-姜酚拮抗乌头碱心动过速作用最强。6-姜酚10μM可显著缩短乌头碱导致斑马鱼心脏SV-BA距离增加;可改善射血分数、增加每搏输出量来拮抗乌头碱导致斑马鱼心脏功能损伤。6-姜酚减弱乌头碱导致的斑马鱼心脏区域ROS含量升高,减少乌头碱导致的斑马鱼心肌细胞凋亡。甘草代表性成分中甘草酸拮抗乌头碱心动过速作用最强。甘草酸可缩短乌头碱导致斑马鱼心脏SV-BA距离增加;可显著改善射血分数、增加每搏输出量来拮抗乌头碱导致斑马鱼心脏功能损伤。甘草酸减弱乌头碱导致的斑马鱼心脏区域ROS含量升高,减少乌头碱导致的斑马鱼心肌细胞凋亡。5、运用网络药理学分析出6-姜酚拮抗乌头碱心脏毒性关键作用靶点为MAPK1、MAP2K1、AKT1、MAPK8、MAPK14、SRC;富集程度较高的通路有雌激素信号通路、PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路等。甘草酸拮抗乌头碱心脏毒性关键作用靶点为MAPK、GRB2、CDC42、EGFR、GSK3B、SRC;富集程度较高的通路有PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路、FoXo信号通路等。结论:1、四逆汤中的乌头碱、次乌头碱、中乌头碱、6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、异甘草素对斑马鱼具有毒性作用,其中乌头碱类成分毒性作用明显,是四逆汤中的主要毒性成分。2、首次研究出乌头碱对斑马鱼具有发育毒性作用,引起斑马鱼严重畸形,导致心脏、肝脏、神经系统发育障碍,氧化应激、线粒体途径凋亡、细胞自噬参与毒性调控机制。3、首次研究出异甘草素斑马鱼具有发育毒性作用,引起斑马鱼严重畸形,导致心脏、肝脏、神经系统发育障碍,氧化应激、线粒体途径凋亡参与毒性调控机制。4、6-姜酚、甘草酸可以显著拮抗乌头碱心脏毒性,并首次利用网络药理学研究出6-姜酚、甘草酸主要通过调控PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路等发挥拮抗作用。