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内切木聚糖酶是木聚糖降解酶系中最关键、最重要的酶,它可将木聚糖分子从内部即β-1,4-糖苷键处将其切断。碱性内切木聚糖酶具有pH值适应范围广、热稳定性好等优点,在造纸、食品和饲料等工业中具有非常良好的应用价值。本文筛选到优质内切木聚糖酶产生菌株Streptomyces sp.WMN-3;并对其所产耐碱耐热的碱性内切木聚糖酶进行了分离纯化;在此基础上,利用PCR法克隆得到新的碱性内切木聚糖酶基因,进而在大肠杆菌中成功进行了表达。本论文的主要内容有:(1)筛选到一批产木聚糖酶菌株。其中,菌株WMN-3产酶能力较强,通过16S rDNA序列种属鉴定为链霉菌(Streptomyces)。与当前工业用酶菌株相比,Streptomyces sp.WMN-3属于嗜碱的极端微生物,可在高碱性条件下(pH9.0)培养,具有可有效抑制杂菌污染,有利于大规模的发酵生产的优点。本论文重点对Streptomyces sp.WMN-3进行研究。(2)利用阳离子交换层析分离到Streptomyces sp.WMN-3产生的优质碱性内切木聚糖酶蛋白。酶学特性研究结果表明,该木聚糖酶反应的pH值以8.0左右为适,在中碱性条件下具有较高酶活和稳定性,反应温度以55℃左右为宜,且具有耐热、耐碱、耐多种金属离子和表面活性剂等强抗逆特性,在造纸等工业中具有良好的应用价值。(3)克隆了Streptomyces sp.WMN-3新的碱性内切木聚糖酶基因。通过Touch down PCR和TAIL-PCR技术从Streptomyces sp.WMN-3的基因组DNA中克隆到酶基因完整开放阅读框(ORF)。该ORF长1476 bp,编码491个氨基酸。BLAST分析结果表明,其氨基酸序列与10家族的Jonesia quinghaiensis木聚糖酶同源性最高,但仅有82%的相似性。根据序列分析结果结合酶蛋白分子量、等电点及酶学特性等方面的差异判断,Streptomyces sp.WMN-3碱性内切木聚糖酶基因为一新发现的β-1,4-内切木聚糖酶基因。(4)实现了Streptomyces sp.WMN-3碱性内切木聚糖酶基因在大肠杆菌中的高效表达。用PCR方法从Streptomyces sp.WMN-3的基因组DNA中扩增出酶基因全长,利用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切将其插入到原核表达载体pET-28a(+)中,得到重组质粒,并转化大肠杆菌E.coli BL21 Star(DE3),经过大量筛选可得到高效表达木聚糖酶的重组大肠杆菌菌株。重组大肠杆菌菌株表达的最高酶活可达131.2 U/m L。通过Ni-Sepharose 6 FastFlow亲和层析分离得到重组酶蛋白XYN-WMN-3,酶学特性研究发现,重组内切木聚糖酶XYN-WMN-3与分离得到的天然酶蛋白的相应酶切特性基本一致,表明该碱性内切木聚糖酶基因在大肠杆菌中已成功表达。