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背景和目的:鲜红斑痣也称为葡萄酒色斑,是一种常见的先天性真皮浅层毛细血管网扩张畸形,发病机制十分复杂,尚不明确。目前研究表明,其发病机制可能包括内皮祖细胞分化发育异常、遗传基因突变、血管生长相关因子表达异常、异常血管周围神经分布异常、脉管系统中蛋白激酶异常激活等五个方面。近年来研究发现,采用传统的被视为金标准治疗方法的脉冲染料激光,多次治疗后仅有约10-20%的患者皮损能完全消退,并且多年后的复发率极高。所以临床上亟需一种治疗效果更佳,更加安全的全新治疗手段。光动力疗法是运用光动力效应的原理进行疾病诊治的一种新技术。基本原理是利用光敏剂或者无毒的染料物质在特定波长的光或激光照射后,与周围组织中的氧分子发生一系列生物化学反应,产生活性氧物质和单线态氧,最终导致细胞凋亡、自噬甚至坏死,血管闭塞、损伤,以及周围组织炎症和免疫反应等作用。其中,海姆泊芬是一种新型的二代光敏剂,具有更稳定的结构、更高的光动力效率,且光活性高、清除率快、毒性低的优点。近年来海姆泊芬介导的光动力治疗已在中国成功地应用于鲜红斑痣的治疗中。近年来,国内外陆续有报道关于光动力疗法治疗鲜红斑痣的临床有效性、安全性、副作用的文献发表,但是其具体治疗机制尚未完全明确。因此,本课题将通过研究HMME-PDT对内皮细胞抑制生长,诱导凋亡,以及调控凋亡的途径来进一步探讨光动力治疗鲜红斑痣的分子生物学机制。方法:1.以HUVEC细胞为体外研究对象来研究海姆泊芬介导的光动力的光毒性作用。用CCK8法检测不同浓度光敏剂和不同剂量光照强度对HUVEC细胞活性的影响;并筛选后续实验使用的处理参数。2.分为非PDT组和HMME-PDT组,采用流式细胞术、DAPI染色法、WB以及qRT-PCR进一步明确HMME-PDT组是否有凋亡迹象的表现,以及对HUCEV细胞Bcl-2和Bax的影响。3.分为对照组、低剂量光动力组和高剂量光动力组,通过ELISA、免疫荧光检测各组细胞VEGF-A的分泌量,Western Blot检测VEGF-A/AKT/mTOR通路中AKT,p-AKT,mTOR,p-mTOR,P70S6,p-P70S6的表达水平。结果:1.在不照光的情况下,经不同浓度的光敏剂处理后的细胞未观察到细胞活力有明显差异,细胞存活率几乎均为100%。与之相对照的光动力处理组,经过光照后各组均出现不同程度的存活率下降。在同一光照条件下,随着光敏剂浓度增加,细胞存活率逐渐下降;并且,在同一光敏剂浓度的条件下,随着光照强度增大,细胞存活率也呈现逐渐下降的趋势。镜下观察到,经光动力处理后的HUVEC细胞开始出现细胞膜小泡形成,折光性差,细胞体积缩小,细胞间连接消失,甚至有细胞漂浮于培养基上。且随光照剂量的增加,这种现象更明显。2.单独的光照或者单独孵育光敏剂几乎不会引起细胞明显的凋亡现象,但是经光动力处理后24小时后在HUVEC细胞中发现了明显的细胞凋亡迹象,细胞出现核固缩、染色质凝聚,甚至细胞核破裂形成碎片、解体。相对于对照组,PDT组中Bax/Bcl-2蛋白比显着增加,同时Bax/Bcl-2 mRNA比率增加的趋势一致。3.经HMME-PDT处理后的细胞VEGF-A的荧光强度及VEGF-A的分泌较对照组明显下降,且随照光剂量的增加下降更明显。与对照组相比,p-AKT、mTOR、p-mTOR、P70S6、p-P70S6的表达均呈现以PDT浓度依赖性的降低趋势,AKT、mTOR、P70S6三组蛋白中各组蛋白磷酸化活化表达也明显受到抑制。结论:1.海姆泊芬光动力在低光动力剂量的情况下对HUVEC细胞也具有非常有效的抑制作用。HMME-PDT对HUVEC细胞发挥细胞毒性作用与光敏剂的浓度及照光强度密切相关。同时,在HUVEC细胞活力研究中也发现在没有光照的情况下,细胞活力几乎没有受到任何影响。2.HMME-PDT 24小时后在细胞中发现了明显的细胞凋亡迹象,这表明细胞凋亡在HMME-PDT的治疗效果中起着至关重要的作用。单独的光照或者单独孵育光敏剂几乎不会引起细胞明显的变化。同时检测到经光动力处理后HUVEC细胞相应的抗凋亡蛋白Bcl-2减少,促凋亡蛋白Bax明显升高。3.HMME-PDT可以抑制VEGF-A的表达,抑制AKT、mTOR和P70S6的活化,通过抑制VEGF-A介导的AKT/mTOR途径的蛋白活化而抑制血管内皮细胞的增殖及血管的重建。