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目的：
1.研究左旋氧氟沙星在体外对肺炎克雷伯菌的耐药诱导作用,构建多重耐药肺炎克雷伯杆菌模型；
2.探讨产ESBLs在多重耐药中作用；
3.研究运用外排抑制剂前后细菌药物敏感性的变化；
4.检测肺炎克雷伯菌QRDR突变情况及其与喹诺酮耐药的关系。
方法：
1.从临床收集17株敏感肺炎克雷伯杆菌,运用左旋氧氟沙星从低浓度至高浓度在体外诱导其成为多重耐药菌株模型；
2.严格按照CLSI指南,运用初筛及确证法检测17株菌株诱导前后产ESBLs情况；
3.分别选用外排抑制剂(EPI)羰基氰氯苯腙(CCCP)及奥美拉唑在20ug/ml及40ug/ml两种不同浓度下与细菌共同培养后,运用琼脂稀释法测定细菌对左旋氧氟沙星敏感性的改变；同时运用纸片扩散法检测耐药株对多重抗生素的药物敏感性；
4.聚合酶链反应(PCR)扩增检测诱导前后菌株gyrA、parC的喹诺酮耐药决定区域(QRDR)突变情况,并探讨突变与喹诺酮耐药的关系。
结果：
1.敏感菌株经过体外诱导后表现为对包括喹诺酮、β-内酰胺类、氯霉素、四环素等多种抗生素在内耐药；
2.临床收集的17株敏感菌及诱导后产生的多重耐药菌株中无一产ESBLs。其中17株敏感肺炎克雷伯杆菌中初筛试验均阴性,诱导后初筛均呈阳性,但经过确证试验后无一为产ESBLs;
3.在CCCP耐药性逆转实验中,泵阳性株达53％,CCCP及奥美拉唑的抑制外排作用有统计学差异,尚不能认为外排抑制剂在高低两种浓度下对菌株的药物敏感性影响有统汁学差异。运用外排抑制剂后菌株对多种抗牛素的抑菌环直径有不同程度的增大。
4.所有耐药肺炎克雷伯杆菌QRDR均发生了变异,绝大部分菌株发生了GyrA和ParC双重突变。GyrA基因以83、87位氨基酸突变为主,其中83位氨基酸均由酪氨酸(Try)突变为异亮氨酸(Ile),87位分别由天门冬氨酸(Asp)突变为甘氨酸(Gly)和精氨酸(Arg)。还有部分菌株84位丙氨酸发生了同义突变(GCG→GCA),86位酪氨酸(Try)突变为幺幺氨酸(Ser),其中Asp87→Arg,Try86→Ser未见有报道。几乎所有菌株ParC基因第80位氨基酸由丝氨酸(Ser)突变为异亮氨酸(Ile)。
结论：
1.起始运用亚抑菌浓度并逐步加大的梯度浓度法体外能成功构建多重耐药肺炎克雷伯杆菌模型,这提示我们临床上长期低浓度运用喹诺酮类抗生素容易诱变多重耐药菌；
2.喹诺酮类不是诱导产生ESBLs的主要因素；
3.主动外排在多重耐药形成中起重要作用,外排抑制剂可以有效提高细菌药物敏感性,但是不能完全逆转耐药性；
4.QRDR突变与喹诺酮耐药密切相关,gyrA突变多见于83、87位氨基酸,parC突变多见于80位氨基酸,同时存在少见位点的突变,其与耐药的相关性有待研究。