Dmrt(Doublesex and mab-3 related transcription factor)基因家族是一类编码转录调控因子的超家族,主要参与脊椎动物的性别分化、性腺发育、配子发生、组织器官形成和功能维持等过程。它编码的转录因子都具有一个保守的DM功能结构域,依靠锌指结构与DNA结合。Dmrt基因家族是目前脊椎动物研究性别决定和分化发育最关键的一类基因家族,而Dmrt1基因也是研究最多并与性别发育分化最相关的一个基因。两栖类作为从水栖向陆栖过渡的一大脊椎动物类群,其复杂的生活习性和独特的繁殖方式使得两栖动物成为我们需要高度关注的群体。然而,与其他脊椎动物相比,两栖类关于性别决定和分化的研究明显滞后。因此我们选取两栖类有尾目和无尾目的6个代表物种,有尾目为巫山北鲵(Ranodon shihi)和红瘰疣螈(Tylototriton shanjing),无尾目为峨眉树蛙(Rhacophorus omeimontis)、华西雨蛙(Hyla annectans)、雷山髭蟾(Vibrissaphora leishanensis)和中华蟾蜍(Bufo gargarizans),作为研究对象来进行两栖类Dmrt相关基因的克隆和进化分析。我们得到如下结果:(1)克隆得到6个物种的Dmrt1基因、雷山髭蟾和巫山北鲵的Dmrt2基因和华西雨蛙的Dmrt3基因的DM结构域序列,序列比对发现三个基因DM域的同源性达到80%以上,系统发生显示在进化上相当保守。(2)利用SMART-RACE技术成功获得了 6个物种Dmrt1基因的cDNA全长序列,均得到完整的开放阅读框和相关功能结构域,可以进行结构、功能和进化分析。其中巫山北鲵全长1,656 bp,开放阅读框1,020 bp,编码339个氨基酸序列;红瘰疣螈全长1,686 bp,包含1,032 bp的开放阅读框,编码343个氨基酸序列;峨眉树蛙全长1,917bp,包含918 bp的开放阅读框,编码305个氨基酸序列;华西雨蛙全长1,938 bp,开放阅读框1,023 bp,编码340个氨基酸序列;雷山髭蟾全长1,194 bp,包含945 bp的开放阅读框,编码314个氨基酸序列;中华蟾蜍全长1,141 bp,包含1,044 bp的开放阅读框可编码347个氨基酸序列。功能域分析显示所有Dmrt1基因均具有DM保守结构域和Dmrt1功能结构域,信号肽检测未发现相关的信号肽切割位点,且Dmrt1为非分泌蛋白和亲水性蛋白。蛋白质二级结构包括α螺旋、延伸链和无规卷曲,DM域三级结构预测的最佳匹配模板为4yj0.1.A,并具有明显的锌指结构。(3)多个物种之间的成对氨基酸距离大于成对核苷酸距离,说明可能存在适应性选择。通过PAML软件codeml子程序对两栖动物的Dmrt1基因进行正选择检测,多种模型只检测到1个氨基酸位点受到显著的正选择作用。虽然检测到的正选择作用较弱,但根据其保守序列同源性较高,推测可能受到基因复制的影响。而且两栖类性染色体在漫长的进化过程中会发生重组,对于Dmrt1基因的进化也会产生影响。(4)对雷山髭蟾雌雄成体的精巢、卵巢、肝脏、心脏、肾和脾组织的Dmrt1表达量进行荧光定量PCR测定,发现Dmrt1基因在雄性精巢表达量显著高于在其他组织的表达量,暗示Dmrt1基因可能与雷山髭蟾雄性性腺发育分化有关。具体性别决定作用有待进一步探索。综合以上结果,Dmrt基因家族是一类在进化上高度保守的基因,同形性染色体的重组和基因复制会对Dmrt1基因的正选择产生影响。同时Dmrt1基因的表达具有显著的雄性特异性,是一个研究两栖类性别决定的良好候选基因。