人乳头状瘤病毒(HPV)是一种高度螺旋的环状双链DNA病毒，90％宫颈癌患者HPV阳性。高危型HPV感染易引起宫颈癌等恶性肿瘤，其中最常见的致癌亚型是HPV16型和HPV18型。HPV病毒基因组由3个区组成：上游调节区(URR)、早期区(E)和晚期区(L)。早期区有8个开放读码框架(ORFs)，分别为E6、E7、E1、E8、E2、E4、E3、和E5。E6和E7是重要的致癌基因，对肿瘤的转化最重要。它通过与宿主细胞调节蛋白相互作用，使肿瘤抑制因子失活，引起宿主细胞的永生化和恶性转化。因此，以HPV为靶的宫颈癌的治疗策略具有十分重要的意义。 双链RNA是存在许多植物、真菌、细菌病毒中的遗传物质。RNA干扰(RNAi)技术是利用外源性双链RNA(dsRNA)诱导产生的序列特异性基因沉默。其作用类似于基因敲除，但较其技术简单、快捷。RNAi可以特异降解相应基因的mRNA，从而抑制该基因的表达。RNAi已在许多生物体内发现，如植物、真菌、果蝇、斑马鱼等。然而，利用38-1662bp长的dsRNA却未在高等哺乳动物细胞诱发RNAi。SiRNA是两端各有两个碱基突出的小于25nt的dsRNA，它不能激活高等哺乳动物中的蛋白激酶K(PKR)及诱发干扰素系统，从而保持了细胞的活性。因此运用SiRNA研究哺乳动物细胞的基因功能及特异性基因沉默成为可行。 目前宫颈癌的基因治疗是研究的一个热点，疫苗、反向基因治疗和自杀基因治疗等尽管取得了一些进展，但存在许多问题。HPVE6/E7是重要的致癌基因，那么能否利用RNAi技术，合成针对HPVE6、E7SiRNA来治疗宫颈癌呢?本研究首先用免疫组化法及RT-PCR法鉴定宫颈癌细胞Hela中有HPV18E6/E7的表达，然后合成21nt的针对HPV18E6、E7的SiRNA，转染Hela细胞后，用免疫组化法检测HPV18E6蛋白的表达，为临床预防和治疗宫颈癌提供新的思路和方法。 1 宫颈癌细胞株Hela中HPV18E6/E7的表达研究博士学位论文 中文摘要 目的：子宫颈癌是女性最常见的生殖系统恶性肿瘤之一，子宫颈癌与高危型 HPV感染有关。本研究检测 HPV18E6亿7在 Hela细胞表达，探讨其在宫颈癌发生中的意义。 方法：运用免疫组化技术检测HPV 8E6蛋白在Hela细胞的表达，用RT－PCR法检狈HPV18E6、E7。RNA在Hela细胞的表达。 结果：Hela细胞中有HPV18E6、E7。RNA及蛋白水平的高表达。 结论：子宫颈癌细胞株Hela中有HPV18E6几7的高表达，高危型HPVE6＊7可能为子宫颈癌治疗的靶基因。 2利用RNA i特异抑制HPV 8E6表达的研究 目的：探索利用RNAi技术研究靶向抑制宫颈癌细胞株Hela中HPV18E6的可行性。 方法：根据哺乳动物 S iRNA设计原则要求，利用 T7 RNA聚合酶体外合成针对HPV18E6、E7的SIRNA，并用2％的琼脂糖电泳鉴定。然后用脂质体转染Hela 细胞，分为4组，A组：HPV18E6的SIRNA 干预组；B组：HPV 18E的SIRNA 干预组；C：HPV18E6、E7的SIRNA 干预组；D：基因组文库任意 SIRNA 为对照组。于转染 48hr、72 hr、96hr后用兔疫组化法测定HPV 8E6蛋白的表达。 结果：干预组A和 C转染后 48hr、72h，，HPV18E6的阳性表达明显减少，以72hr为明显，96hr后表达无明显减少。而干预B组和对照 D组的 HPV18E6的阳性表达无明显改变。 结论：靶向HPV 8E6的SIRNA能特异瞬时抑制靶基因E6的表达，该方法将为宫颈癌预防和治疗提供新的策略。 结 论 1．宫颈癌细胞Hela 中有HPV18E6、E7的mRNA禾蛋白的表达。 2．高危型HPVISE6、E7可能成为治疗宫颈癌的靶基因。 3．靶向 HPV18E6 的 SIRNA 能瞬时抑策 E6蛋白的表达。 4．利用 RNAi技术合成针对高危型HPV18E6、E7的 SIRNA 可能成 为宫颈癌预防和治疗的新方法。