超声场强对生物膜态荧光假单胞菌应激反应影响及调控手段研究

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超声波技术可作为食品加工过程中一种非热杀菌手段,在保障食品安全的前提下最大限度地保留食品中的营养成分。同时,超声波也是一种食用农产品的高效清洗技术,在保障食品品质的前提下清除食品表面的污渍和细菌。荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)是一种常见的食源性致病菌,具有很强的生物膜形成能力。生物膜态的荧光假单胞菌对热处理和机械清洗的抵抗力显著增强。超声波清洗利用的是超声空化效应以及产生的瞬时高温高压、活性自由基和强剪切力达到清除作用,但是由于超声波在清洗介质和植物组织中衰减速度较快,作用于菌体生物被膜时清除和杀菌效果并不理想,还能使细菌产生应激效应,增加其抗逆性。基于上述背景,研究了不同超声场强对生物膜态荧光假单胞菌应激反应影响并提出了调控手段。首先研究了不同场强的超声作用对荧光假单胞菌生物被膜的结构、功能及其内部菌体群体感应的影响。研究表明:低场强超声作用使荧光假单胞菌产生应激现象,应激后的菌体运动性、胞外多糖产量、胞外蛋白酶活性和生物被膜形成量均高于未超声处理组(p<0.05)。高场强超声作用下荧光假单胞菌的生长受到抑制,生物被膜量减少,群体感应系统受抑制。电镜观察结果也验证了不同超声场强对菌体形态及其生物被膜结构的影响。低场强超声作用使荧光假单胞菌的C8-HSL信号分子合成量提高了26.2%,同时调控信号分子合成的pco I基因相对表达量上调了2.16倍。生物被膜相关基因flg A、alg D、apr X和lap A的表达量也显著增加;然而上述基因表达量在高场强超声作用后显著下调。基于转录组学的群体感应系统研究结果与电镜结果相印证,表明低场强超声波可激活荧光假单胞菌群体感应系统,使其生物被膜形成能力显著增强,增加抗逆性。对于低场强超声波激活荧光假单胞菌群体感应系统的现象进行了蛋白质组学研究,结果表明:经过超声波作用的荧光假单胞菌蛋白有183个发生显著性差异表达(p<0.05),其中164个蛋白表达量上调,19个蛋白表达量下调。将差异蛋白进行分析后发现:超声后激活了鞭毛组装系统的蛋白,使细菌趋向性发生改变,大量双组分系统的蛋白开始调控,ABC转运蛋白加快了细胞膜上的物质跨膜运输,使细胞膜内外的渗透压保持平衡。此外,超声作用后与DNA修复相关的蛋白表达上调,说明细菌应激后能够在一定程度上修复受损伤的DNA。其次,探究了不同场强超声作用对球心生菜表面生物被膜态荧光假单胞菌的清除能力以及超声清洗对球心生菜在储藏期内品质变化影响。高场强超声对球心生菜表面的生物被膜有较好的清除能力,高场强超声能够降低94.7%生菜表面的微生物数量,能延长2 d的储藏时间,4 d后生菜表面的菌落总数超过10~5 CFU/g且开始褐变。同时超声波处理能减缓储藏期间球心生菜失重率、色差及丙二醛的上升,能延缓球心生菜中p H、总酚含量的下降及叶绿素的降解。最后,探究了声-热协同(US-TM)处理生物被膜态荧光假单胞菌后生物被膜的清除和内部菌体的杀菌效果。首先基于多元物理场耦合:频域压力声学、非等温流、K-ε湍流和传热模型,模拟声-热协同过程中清洗容器内部及壁面的声压和温度分布。结果表明:当超声场强为15.79、21.06和26.32 W/cm~2时,荧光假单胞菌生物被膜中心受到的声压分别为1.67×10~4、1.93×10~4和2.15×10~4 Pa。反应容器的高温区分布在超声探头表面,当超声场强为26.32 W/cm~2时,核心温度分别达到43.96、53.89和64.53℃。随着目标位置和超声波探头之间距离的增加,温度迅速下降到外部循环冷却水的温度。生物被膜生长的壁面声压存在高/低区域,其边界和内部的温度也存在差异,而低声压低温度区域可能成为潜在的卫生死角,生物膜可能无法得到有效清除。因此,改变声-热处理条件或优化容器设计,可消除潜在的卫生死角,避免生物被膜残留导致的食品二次污染。不同声-热协同处理对生物被膜的清除和内部菌体杀菌效果差异显著,采用>21.06 W/cm~2超声场强和50℃超声温度的声-热协同处理,可实现生物被膜态荧光假单胞菌的高效清除(清除率>65.6%)和内部菌体的高效杀菌(杀菌率>99.9%)。因此,声-热协同处理可成为食品工业化清洗中控制食源性微生物生物被膜的潜在技术手段。
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