论文部分内容阅读
目的:维吾尔医学、药学是我国传统医药的重要组成部分,维医认为高血压的发生是人体内四种体液质失衡所导致的,因此采取调节、成熟以及清除疗法,改善体内异常体液来治疗高血压。有临床研究表明复方高滋斑片能有效治疗胆黑质异常所引起的高血压症,但暂无任何关于其药效学的研究报道,其作用机制和有效物质基础也尚不明确。本论文通过顶空固相微萃取-气质联用技术对复方高滋斑片及主要药味牛舌草和牛舌草花中的挥发性成分进行了分析;通过自发性高血压大鼠模型来探究复方高滋斑片的药效学及其改善肾损伤机制的研究,为复方高滋斑片治疗高血压提供理论基础和实验依据。方法:通过顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）技术分析复方高滋斑片及牛舌草和牛舌草花中的挥发性成分,探究其潜在的有效物质基础。将40只12周龄的自发性高血压大鼠（Spontaneously hypertension rats,SHR）随机分为:模型组、阳性药组（酒石酸美洛托尔片组）、复方高滋斑片高、中、低剂量组;另设正常组为8只同周龄的Wistar-Kyoto（WKY）大鼠,每天以10 m L/kg的灌胃体积,连续口服给予复方高滋斑片9周,并每周定时测量大鼠收缩压（SBP）。给药9周后处死各组大鼠并取材,检测大鼠血清中甘油三酯（Triglyceride,TG）、总胆固醇（Total cholesterol,TC）、葡萄糖（Glucose,Glu）、高密度脂蛋白胆固醇（High density lipoprotein cholesterol,HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（Low density lipoprotein cholesterol,LDL-C）的血脂水平,同时还检测谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase,ALT）、谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase,AST）、谷胱甘肽S转移酶（Glutathione S-transferase,GST）肝功能水平,用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测大鼠血清中肾素（Renin）、血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ,AngⅡ）、醛固酮（Aldosterone,ALD）、内皮素1（Endothelin-1,ET-1）的水平;通过HE染色和Masson染色观察大鼠心脏和肾脏的病理变化,并对胶原面积进行统计学分析。实时荧光定量PCR法检测大鼠肾脏中血管紧张素转化酶（Angiotensin-converting enzyme,ACE）、血管紧张素Ⅱ1型受体（AngiotensinⅡtype 1 receptor,AT1R）和内皮型一氧化氮合成酶（Endothelial nitric oxide synthase,e NOS）、磷酸肌醇3-激酶（Phosphoinositide3-kinase,PI3K）、蛋白激酶B（Protein kinase B,AKT）的相对表达量。蛋白免疫印迹反应（Western blotting）检测大鼠肾脏中PI3K、AKT、p-AKT（Phospho-protein kinase B,磷酸化蛋白激酶B）的相对表达水平。结果:1.通过顶空固相微萃取-气质联用技术并结合数据库匹配对复方高滋斑片、牛舌草及牛舌草花中的挥发性成分进行鉴别。其中,复方高滋斑片中共鉴别出39种挥发性成分,含量较高的成分有顺式-α-檀香醇占15.29%,β-檀香醇占10.49%,反式-α-香柠檬醇占8.42%、（E）-香榧醇占6.96%、香叶基香叶醇占4.80%;牛舌草中共鉴别出31个挥发性成分,含量较高的成分有正二十七烷占14.06%、植酮占13.62%、2,6,10-三甲基十四烷占6.71%、顺式-α-檀香醇占6.39%;牛舌草花中共鉴别出27个挥发性成分,含量较高的成分有二十三烷占25.96%、顺式-α-檀香醇占21.37%、反式-β檀香醇占8.41%、植酮占6.08%、反-α-香柠檬醇占5.92%。2.血压结果显示,与模型组比较,经复方高滋斑片给药2周后,低剂量组大鼠的收缩压有显著下降（P<0.05）,灌胃9周后,高剂量组和中剂量组大鼠的收缩压均明显下降（P<0.05）。检测大鼠血清中血脂水平,发现与模型组比较,复方高滋斑片高剂量组和中剂量组的大鼠血清中的TG和HDL-C的水平有显著性的降低作用（P<0.05）,但对大鼠血清中的Glu、TC和LDL-C均无影响（P>0.05）。检测大鼠血清中的转氨酶水平,发现与模型组比较,复方高滋斑片对大鼠血清中的AST、ALT和GST的水平均有不同程度的降低作用（P<0.05,P<0.01）;病理组织学观察显示,与模型组比较,复方高滋斑片能有效改善自发性高血压大鼠肾小球和肾小管的形态,减少炎性细胞的浸润,使其形态更接近正常组,同时复方高滋斑片还能减少心肌细胞的凋亡,减少心肌纤维的断裂和增生,改善心肌细胞的损伤。3.采用ELISA法检测大鼠血清中肾素、血管紧张素Ⅱ、醛固酮、内皮素1的水平,结果显示,与模型组比较,经复方高滋斑片治疗后,高剂量组和中剂量组均能显著性降低大鼠血清中Renin、AngⅡ、ALD、ET-1的含量（P<0.05）。实时荧光定量PCR结果显示,与模型组比较,复方高滋斑片中剂量组和低剂量组大鼠肾组织中的ACE m RNA和AT1R m RNA均有所下调（P<0.05）,而对e NOS m RNA有显著的上调作用（P<0.05）。4.MASSON染色结果显示,与模型组比较,经复方高滋斑片给药后,高剂量组和中剂量组大鼠肾脏中的胶原纤维面积显著减少（P<0.05）,其中中剂量组的胶原纤维面积极显著减少（P<0.01）,接近正常组。蛋白免疫印迹结果显示,与正常组比较,模型组大鼠肾脏中的PI3K蛋白和p-AKT蛋白表达均显著性降低（P<0.05）,经复方高滋斑片治疗后,高剂量组、中剂量组、低剂量组的大鼠肾脏中的PI3K蛋白和p-AKT蛋白表达均有上调（P<0.05）,且呈一定的剂量依赖性。荧光实时定量PCR结果显示,与与正常组比较,模型组大鼠肾脏中的PI3K m RNA和AKT m RNA表达均显著性降低（P<0.05）,经复方高滋斑片治疗后,高剂量组、中剂量组、低剂量组的大鼠肾脏中的PI3K m RNA和AKT m RNA表达均有上调（P<0.05）,且呈一定的剂量依赖性。结论:1.复方高滋斑片方中大部分药味是芳香类的药材,其挥发性成分主要是檀香醇类的成分,同时也是牛舌草、牛舌草花及檀香中的主要挥发性成分,药理研究表明檀香醇类化合物具有良好的抗炎镇静的作用;β-没药醇、反-α-香柠檬醇是牛舌草花中的挥发性成分,其中β-没药醇具有抗炎、镇静的功效;十五烷、α-雪松烯均来自牛舌草中;α-姜黄烯可以归属到牛舌草和檀香中,具有良好的抗氧化的作用;顺-β-金合欢烯、氧化石竹烯来自薰衣草中;库贝醇是香青兰中的挥发性成分;α-檀香烯可以归属到檀香和薰衣草中;香叶基香叶醇能够抗血栓及动脉粥样硬化。从以上分析结果可初步确定挥发性成分是复方高滋斑片主要的药效物质之一。2.复方高滋斑片具有一定的降低自发性高血压大鼠收缩压的作用,虽然未能使大鼠血压达到正常水平,但长期服药后可使自发性高血压模型大鼠收缩压维持于一个较低的水平,稳压效果明显;复方高滋斑片有较好的护肝功能;综合HE染色结果可以明显看出复方高滋斑片能显著改善高血压引发的肾脏和心脏的损伤,有效减缓高血压病的发生和发展、预防和修复心肾等脏器的器质性损伤。3.复方高滋斑片能有效抑制RAAS（肾素-血管紧张素-醛固酮）的过度激活,通过降低Renin,AngⅡ,ALD的含量,从而降低交感神经兴奋性;同时ET-1的含量降低使得血管的扩张能力加强,减少血管周压力,从而达到降低血压的作用;PCR结果显示,复方高滋斑片能下调ACE,AT1R m RNA的表达,上调e NOS m RNA的表达,也是通过基因调控抑制了RAAS的过度激活。4.复方高滋斑片能显著降低大鼠肾脏中的蓝色胶原纤维面积,避免了肾损伤病变的加剧导致的肾纤维化;WB和PCR试验结果均显示出复方高滋斑片能激活细胞存活、增殖通路PI3K/AKT,显著上调PI3K和AKT的表达,从而改善了肾脏的损伤,大大的减缓了肾脏纤维化的进程。