研究目的随着研究技术的进步尤其是分子生物学技术的发展，近年来恶性肿瘤发生及进展机制研究也取得了一定进展，并且部分研究成果已进入临床应用阶段，如胃肠道间质瘤的分子靶向治疗的临床有效率可高达80％，但是对恶性程度极高的实体瘤如胰腺癌仍然缺乏有效的治疗手段。最近研究提出的恶性肿瘤干细胞起源理论为进一步阐明其发生及进展机制、指导临床治疗、提高治疗水平带来了新的希望。近年来，有研究者在乳腺癌、肺癌、小脑胶质瘤和前列腺癌等多种实体瘤中分离出了肿瘤干细胞，并认为肿瘤干细胞为恶性肿瘤的起源细胞，在肿瘤发生、发展、复发和转移中起到关键作用。王春友教授在国内外研究基础上，提出胰腺癌中同样存在胰腺癌干细胞，并进行胰腺癌干细胞分离、鉴定及其起源的研究工作，该研究获得国家自然科学基金(项目编号NO．30571817)和教育部博士点基金(项目编号NO．20050487077)资助。本实验旨在证实胰腺癌中存在胰腺癌干细胞，并探讨胰腺癌干细胞起源的可能机制，为针对胰腺癌干细胞的治疗策略研究提供理论依据与实验数据，最终提高胰腺癌的临床治疗水平。研究方法本课题利用特殊培养条件，在体外选择性扩增PANC-1胰腺癌细胞系中具有肿瘤干细胞特性的细胞亚群，进而通过体外增殖能力测定、Hoechst 33342染料外排实验及裸鼠成瘤实验等证实所获细胞亚群即为胰腺癌干细胞。继而利用实时定量RT-PCR技术检测胰腺癌干细胞表面干细胞标志物表达水平，进一步明确胰腺癌干细胞的生物学特性。通过免疫组织荧光技术检测CD24等干细胞标志物在胰腺导管上皮中的表达情况；通过密度梯度离心技术获得小鼠胰腺导管细胞，并利用流式细胞分选技术将胰腺导管细胞分离为CD24~+和CD2~-4细胞亚群，对各亚群细胞进行CK19和Insulin表达水平检测、体外增殖能力测定、向胰岛β细胞和胰腺腺泡细胞转化能力测定。全骨髓培养法获取小鼠骨髓间充质细胞，通过流式细胞术检测骨髓间充质干细胞表面标志物的表达，绘制细胞增殖曲线评价细胞增殖能力，通过在成骨、成软骨和成脂诱导培养基中培养诱导骨髓间充质干细胞向骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化。PEG化学诱导C57BL／6J-Tg(pPGKneobpA)3Ems小鼠胰腺导管细胞与GFP转染的骨髓间充质干细胞的融合，G418筛选与流式分选纯化融合细胞，绘制融合细胞增殖曲线检测细胞增殖能力，软琼脂克隆形成实验检测融合细胞锚定依赖性，Transwell实验鉴定融合细胞移动与侵袭能力；体外长期培养融合细胞，并以骨髓间充质干细胞和胰腺导管细胞为对照，光学显微镜下寻找并扩增恶性转化克隆；绘制细胞增殖曲线评价恶性转化细胞增殖能力，软琼脂克隆形成实验检测恶性转化细胞锚定依赖性，流式细胞术分析恶性转化细胞染色体倍数，核型分析寻找非整倍体细胞，Transwell实验鉴定恶性转化细胞的移动与侵袭能力，NOD／SCID鼠成瘤实验鉴定恶性转化细胞的成瘤能力。对比恶性转化的融合细胞与胰腺癌干细胞的生物学特性，探讨胰腺癌干细胞的可能起源。实验结果PANC-1胰腺癌细胞中存在肿瘤干细胞亚群，这群细胞所占比例为9．83％±2．61％。胰腺癌肿瘤干细胞中98．10％±1．26％能排出Hoechst 33342染料，裸鼠皮下成瘤实验显示5×10~5细胞即可形成肿瘤。此群细胞高表达CD44、Sca-1和ESA，CD34表达水平较低，但远高于一般胰腺癌细胞，c-met表达水平与一般胰腺癌细胞无显著差异。部分胰腺导管细胞表达CD24，CD24~+细胞主要分布于小叶间胰管上皮和小叶内胰管上皮，CD24~+细胞主要分布于主胰管上皮和闰管上皮。CD24~-胰腺导管细胞较CD24~+导管细胞具有更强的增殖能力，在无血清培养基中培养后可经bFGF诱导分化为胰岛β细胞。联合G418筛选与流式细胞分选PEG融合细胞可获得纯化的融合细胞。胰腺导管细胞在与骨髓间充质干细胞融合后部分融合细胞丧失锚定依赖性。经过长期体外培养后，融合细胞易发生染色体与丢失，产生非整倍体细胞，并发生恶性转化。恶性转化的融合细胞种植至NOD／SCID鼠皮下后能形成肿瘤组织。实验结论：1．胰腺癌细胞中存在胰腺癌干细胞亚群，胰腺癌干细胞能特异性排出Hoechst33342染料，较一般胰腺癌细胞具有更强的成瘤能力。2．胰腺癌干细胞特异性高表达CD44、Sca-1和ESA，CD34表达水平较低，但远高于一般胰腺癌细胞，c-met表达水平与一般胰腺癌细胞无显著差异。3．小鼠部分胰腺导管细胞表达CD24。高表达CD24的导管细胞增殖能力差，不能分化为胰岛β细胞；低表达／不表达CD24的导管细胞增殖能力强，且能分化为胰岛β细胞，胰腺干细胞在此群细胞中富集。4．PEG化学融合联合应用G418筛选技术和流式分选技术可获得纯化融合细胞。5．部分胰腺导管细胞与骨髓间充质干细胞融合后丧失锚定依赖性，迁移能力增强。6．胰腺导管细胞与骨髓间充质干细胞的融合细胞长期培养后易发生自发恶性转化，恶性转化细胞与胰腺癌干细胞生物学特征类似。通过以上研究，得出以下几个创新点：1．首次利用体外选择性增殖的方法获得胰腺癌干细胞，证实胰腺癌中存胰腺癌干细胞亚群，并且研究了胰腺癌干细胞表面标志物的表达，提出CD44、Sca-1和EsA可作为胰腺癌干细胞流式分选的候选表面标志物。2．发现部分胰腺导管细胞表达CD24，证实低表达／不表达CD24的导管细胞具有胰腺干细胞特性，且bFGF在胰腺导管细胞向胰岛β细胞分化过程中起重要作用。提出国外同类研究将胰腺导管干细胞向胰岛β细胞分化时失败的原因可能是诱导分化环境不适合。3．改良现有化学融合技术，使参与融合的两种细胞分别通过转染／转基因动物方式表达GFP与neo，进而通过流式细胞术与G418筛选融合细胞。研究结果显示本改良技术能高效获得纯化的融合细胞。4．首次提出骨髓间充质干细胞与器官原位细胞的融合细胞可能是肿瘤干细胞的起源细胞，并通过实验证实与骨髓间充质干细胞融合后，胰腺导管细胞移动能力增强，丧失锚定依赖性，易发生恶性转化，转化后的细胞类似于胰腺癌干细胞。