在正常怀孕时，母体免疫系统进入一种特定的状态。胎儿作为“半同种移植物”却不被母体排斥的现象似乎与经典的移植免疫的理论相矛盾。通过对人类子宫内膜植入位点周围淋巴细胞的研究，人们发现人类NK(CD56brightCD16dim)细胞在其中占有绝对多数，其比率达到70％以上，该群细胞又被称为uNK细胞。利用组织学的方法也可观察到孕鼠子宫植入位点周围蜕膜区中，uNK细胞占到30％。尽管它们有着潜在细胞毒作用，但在正常妊娠时，并没有杀伤这些滋养层细胞，其中的机制至今未明，推测uNK细胞对母胎免疫起负调节作用，在维持母胎免疫耐受中起重要作用。因此，分离和鉴定uNK细胞对于发现NK细胞的特有亚群及其功能以及相关免疫性疾病有十分重要意义。小鼠是开展免疫学研究的主要动物模型，建立有效的小鼠子宫蜕膜淋巴细胞分离及鉴定方法是研究uNK细胞的关键。 由于分离和培养小鼠uNK细胞的难度较大，过去对于此群细胞的研究多是采用组织形态学的方法(如免疫组化方法)，该方法受到抗体灵敏度的限制，实验周期较长，各实验室之间难于统一标准，假阳性和假阴性的可能性较大。该实验拟在国际上首次用机械法和酶消化法分离小鼠子宫淋巴细胞并利用流式细胞术对小鼠子宫uNK细胞的表型进行鉴定。流式细胞仪能够快速的、定量的、多参数的分析单个活(或死)的细胞，并能进行细胞亚群的分析。这将有助于了解母胎界面的免疫微环境，为探讨母胎免疫耐受机制，尤其是高比例uNK细胞所发挥的免疫学作用奠定重要的实验基础。 主要研究内容及方法: 1.分离小鼠子宫蜕膜淋巴细胞方法的建立 成功的建立了机械法和胰酶消化法分离小鼠子宫蜕膜淋巴细胞的方法。酶消化法细胞得率是机械法的两倍。通常，机械法1只12～14周龄的怀孕中期(gd=10)的怀有9～10胎的孕鼠中可以分离得到0.5～1×106个细胞；酶消化法可以分离得到1～2×106个细胞。进一步分析三类淋巴细胞：T，NK，NKT细胞亚群的比例受分离方法的影响，发现酶消化法并未降低DX5+NK细胞的比例，子宫中T淋巴细胞及NKT细胞的比例在机械法与消化法之间也没有区别。即：T，NK，NKT三类淋巴细胞的相对比例在机械法与消化法之间没有发现显著性差异。然而酶消化使小鼠uNK细胞的CD69表达明显上调。鉴于此，研究者用机械法分离得到小鼠子宫淋巴细胞进行流式细胞术检测，以得到其表型的稳定结果。 2.流式细胞术对小鼠子宫内膜淋巴细胞亚群的鉴定 在怀孕第10天(gd10)的C57BL/6J小鼠子宫蜕膜中，uNK细胞(NK1.1+CD3-)构成最主要的淋巴细胞亚群，占总淋巴细胞数比例的48.74％，且处女鼠中子宫内膜NK细胞的比例明显低于孕鼠，约为35.66％。T细胞(CD3+NK1.1-)构成了小鼠子宫内膜淋巴细胞的第二大亚群，占总淋巴细胞数比例的30.06％，并且CD4+T/CD8+T的比值为2，孕鼠与处女鼠之间无显著性差异。同时发现NKT细胞的比例在怀孕后也有一个明显的增长，其比例为4.2％。CD19+B细胞在子宫内膜的存在微乎其微，但与子宫内膜结合的胎盘中，B淋巴细胞为主要的淋巴细胞。 3.流式细胞术分析小鼠子宫蜕膜淋巴细胞各亚群比例的动力学变化 子宫内膜uNK细胞比例随着怀孕天数的增长，经历着一个动力学的变化过程。受精卵的植入一般发生在怀孕第4天。在C57BL/6J小鼠，当检测怀孕6天(gd6)小鼠的子宫蜕膜淋巴细胞时，其数目比处女鼠有了明显增长，uNK细胞大量出现(26.21±4.76％)，之后随着怀孕天数的增长，uNK细胞迅速增殖，在怀孕的第10天(gd10)，NK细胞的比例达到最高峰(43.07±12.93％)，之后uNK细胞减少，到怀孕的第12天(gd12)，uNK细胞比例下降明显(38.57±0.98％)。到怀孕第14天时(gd14)时，uNK细胞比例已下降到较低水平，到怀孕末期uNK细胞几乎消失。与此同时，NKT细胞的比例也经历着相似的动力学变化过程,NKT细胞的比例在小鼠怀孕第10天(gd10)达到最高峰。BALB/C小鼠子宫uNK细胞比例经历着与C57BL/6J小鼠相似的变化过程。为了验证流式结果的正确性，研究者对怀孕十天和十二天的小鼠子宫进行了固定，包埋并做组织学PAS染色。结果证明，uNK细胞的数量在正常怀孕老鼠于第10天达到最高峰，从怀孕第12天uNK细胞数量开始迅速下降。 4.流式细胞术分析小鼠子宫uNK细胞的表型 研究者利用流式细胞术分析和比较了NK细胞活化性受体NKG2D和抑制性受体NKG2A在uNK细胞上的表达。几乎所有小鼠子宫uNK细胞均高表达NKG2D，而且NKG2D的表达水平在子宫和其他外周脏器(脾脏，肝脏，外周血)之间没有显著性差异。在C57BL/6J和BALB/C鼠中，均约有一半的小鼠uNK细胞为NKG2A/C/E+。其阳性比率在子宫和其他外周脏器(脾脏，肝脏，外周血)之间没有显著性差异。又进一步检测了NKG2A在C57BL/6J鼠uNK细胞的表达，平均35.22±2.2％小鼠uNK细胞表达NKG2A，而55.60±2.60％肝脏NK细胞表达NKG2A。uNK细胞表达NKG2A的水平比肝脏NK低，这与人的报道相反。约58％的子宫uNK细胞表达CD94。这在一定程度上与NKG2A/C/E的表达相对应。对于NKG2D，NKG2A/C/E，NKG2A，CD94的表达水平，随着怀孕天数的增长，表达水平没有显著性差异。孕鼠与处女鼠之间也没有显著性差异。 5.流式细胞术分析小鼠子宫uNK细胞亚群uNK细胞包括NK1.1+DX5+细胞，和NK1.1+DX5-细胞，其中前者占绝对多数，uNK细胞高表达CD122，uNK细胞的在发育上属于成熟的NK细胞亚群。 结论: 1.小鼠子宫蜕膜淋巴细胞可以用机械法或酶消化法分离得到。机械法相对稳定，结果平行性好； 2.鼠子宫蜕膜淋巴细胞主要有NK，T和NKT等细胞亚群，怀孕中期NK细胞占绝对多数； 3.小鼠子宫中存在大量的uNK细胞。小鼠怀孕早期和中期，uNK细胞占子宫淋巴细胞的比例随着怀孕天数的增长而增长，到怀孕的第10天达到高峰，第12天之后开始迅速下降； 4.小鼠uNK细胞均表达NKG2D，约35.22±2.20％的uNK细胞表达NKG2A，表达水平在各个怀孕时间点之间并没有明显变化； 5.流式分析表明uNK细胞属于较为成熟的NK细胞亚群。