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背景随着缺血性疾病日益增多,各种缺血性疾病已成为世界上致残率和致死率最高的疾病之一,而干细胞治疗研究可能给患者带来新的希望。基于内皮祖细胞(EPCs)的干细胞移植能有效保护缺血组织的完整性及功能。血管生成是指在原有的毛细血管和(或)微静脉基础上以芽生或非芽生方式形成新的血管,涉及成熟血管内皮细胞增殖和迁移;内皮细胞增殖迁移对于血管新生具有重要作用。信号转导和转录活化因子3(STAT3)一方面通过血管内皮生长因子(VEGF)促进EPCs增殖分化为内皮细胞,另一方面通过促进Wnt-5a/β-catenin通路激活,有利于血管内皮细胞介导的血管新生,进而缓解下肢缺血。研究证实mi R-320是具有显著的抗血管生成作用的一类mi RNA。牛磺酸上调基因1(TUG1)一种在血管内皮细胞中保守表达的lnc RNA,并具有重要的促血管内皮细胞增殖迁移并抑制其凋亡从而促进血管生成的作用。本实验首先在动物体内研究不同缺血时间与lncRNA TUG1、mi R-320、STAT3、VEGF、Wnt-5a、β-catenin的表达变化;然后培养EPCs,研究其增殖、迁移及成血管能力,最后将其移植到下肢缺血裸鼠体内证实其对缺血的改善,并对比缺血改善与lnc RNA TUG1、mi R-320、STAT3、VEGF、Wnt-5a、β-catenin的表达关系。第一部分下肢缺血不同时间的组织损伤情况目的:探讨lnc RNA TUG1、mi R-320、STAT3、VEGF、Wnt-5a和β-catenin在下肢缺血裸鼠模型中的表达与缺血时间的变化。方法:选取20只6周龄裸鼠随机分为5组,每组4只:(1)缺血48h组;(2)缺血24h;(3)缺血12h;(4)缺血6h组;(5)空白对照组。每组饲料喂养4周,监测裸鼠体重,建立下肢缺血裸鼠模型。48h后用激光多普勒检测缺血下肢血流的变化,然后解剖下肢,分离腓肠肌,用HE染色观察其病理损伤程度,western blot及q RT-PCR实验,分析lnc RNA TUG1、mi R-320、STAT3、VEGF、Wnt-5a和β-catenin表达变化与下肢血流变化及下肢缺血病理情况的相关性。结果:下肢血流结果:与对照组相比,裸鼠下肢血流速度在缺血后6h、12h、24h48h均显著下降。HE染色结果:与对照组相比,腓肠肌细胞在缺血6h到12h变化不明显,而在12h、24h、48h内随着缺血时间延长,胞质嗜酸性逐渐增强,细胞坏死增加。腓肠肌q RT-PCR结果显示:与对照组相比,随着缺血时间延长lnc RNA TUG1基因表达逐渐下降、mi R-320基因表达逐渐上升。Western blot结果显示:与对照组相比,随着缺血时间延长,STAT3、VEGF、Wnt-5a和β-catenin表达逐渐下降。结论:在缺血48h内,随着缺血时间增加,腓肠肌损伤逐渐加重,可能与抑制了lnc RNA TUG1表达,促进了mi R-320表达有关。第二部分EPCs鉴定及培养目的:体外研究裸鼠骨髓来源的EPCs增殖分化、迁移及成血管能力。方法:将裸鼠脱颈致死,取出股骨和胫骨;培养基冲洗骨髓,收集冲洗液,用EPCs专用培养基培养细胞。14d后收集,做流式鉴定,并采用CCK-8、Transwell及基质胶检测EPCs增殖、迁移能力及检测成血管能力。结果:裸鼠骨髓来源的细胞CD14阳性率99.9%,CD34的阳性率86.4%,KDR的阳性率0.1%;EPCs在1-5天内逐步增殖生长;并且在48h的迁移细胞量多于24h;部分EPCs在24h可以看到生成细胞簇,在48h细胞簇更多。结论:裸鼠骨髓来源的细胞中含有EPCs,且其具有生长增殖、迁移及成血管能力。第三部分EPCs移植对裸鼠下肢缺血的影响目的:探讨lnc RNA TUG1、mi R-320在EPCs移植后对下肢缺血改善后的变化。方法:选取10只6周龄裸鼠随机分为2组,每组5只:(1)缺血48h+EPCs组;(2)缺血48h+NS组。每组饲料喂养1周,监测裸鼠体重,建立下肢缺血裸鼠模型。用激光多普勒检测缺血后2d,5d,9d的血流动力学变化,第9d后解剖下肢,分离腓肠肌,用HE染色观察其病理损伤程度,免疫组化检测腓肠肌微血管密度。western blot及q RT-PCR实验,分析lnc RNA TUG1、mi R-320、STAT3、VEGF、Wnt-5a和β-catenin表达变化与下肢血流变化及下肢缺血病理情况的相关性。结果:下肢血流结果:与对照相比,注射EPCs的裸鼠下肢血流相比注射NS组在缺血48h后第5天恢复效果较好。HE染色结果:与对照组相比,注射EPCs组的下肢相比注射NS组腓肠肌细胞嗜酸性降低,细胞坏死减少。免疫组化结果:与对照组相比,注射EPCs的腓肠肌相比注射NS组的微血管密度增加较多。腓肠肌q RT-PCR结果显示:与对照组相比,注射EPCs的腓肠肌与注射NS组相比,lnc RNA TUG1基因表达上升、mi R-320基因表达下降。Western blot结果显示:与对照组相比,注射EPCs的腓肠肌相比注射NS的STAT3、VEGF、Wnt-5a和β-catenin蛋白表达增加。结论:在缺血48h后,EPCs有助于裸鼠下肢腓肠肌缺血的改善,且可能与促进了lnc RNA TUG1表达、抑制了mi R-320表达有关。