论文部分内容阅读
本实验应用外源性神经营养素-3（neurotrophin-3, NT-3）和维甲酸（retinoicacid, RA）在体外预诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,MSCs)，促进其NT-3特异性受体酪氨酸激酶C（tropomyosin receptor kinase C,TrkC）的表达并定向诱导MSCs向神经细胞分化。在TrkC基因表达最高时，将预诱导的MSCs移植入大鼠全横断脊髓损伤处，观察其在督脉电针引起内源性NT-3分泌增高的脊髓损伤微环境中的存活情况及其向神经元样细胞和少突胶质细胞样细胞的分化情况，为今后临床上治疗急性脊髓损伤提供实验资料和新的治疗策略。本实验研究分以下两部分：第一部分督脉电针对早期受损伤的脊髓组织神经营养素-3（NT-3）表达的影响目的探讨脊髓损伤早期应用督脉电针后脊髓损伤处及其附近组织内源性神经营养素-3(NT-3)的分泌情况并观察NT-3的细胞定位。方法横断成年SD大鼠脊髓T10后，电针+损伤组和电针+假手术组大鼠在术后第1d开始接受隔日1次的督脉电针治疗，单纯损伤组不进行电针治疗。电针后1天、3天和7天时取部分大鼠脊髓损伤区及附近脊髓组织，提取其中的蛋白质，用ELISA的方法检测各分组中NT-3在各时间点上浓度的变化。部分实验组大鼠在治疗7天后灌注固定、取材、组织切片，进行免疫荧光组织化学染色。免疫双标法：NT-3/MAP2、NT-3/GFAP、NT-3/APC和NT-3/OX-42检测NT-3的细胞来源。结果与损伤组大鼠脊髓损伤区及其邻近组织NT-3水平相比，电针+损伤组大鼠的NT-3水平在1d、3d和7d3个时间检测点的变化趋势基本一致；即在脊髓损伤早期（前3d）NT-3的水平是降低的。但是在7d时，电针+损伤组的NT-3水平要比损伤组的明显增高(P <0.05)。但与电针+假手术组相比，电针+损伤组的NT-3水平在3d时明显偏低(P <0.05)。到7d时其NT-3水平升高到与电针+假手术组没有差异(P>0.05)。免疫荧光双标染色结果显示：神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和炎症细胞内都有NT-3的存在。结论督脉电针可以促进受损伤早期的脊髓组织细胞合成和分泌内源性NT-3，这可能是督脉电针促进急性脊髓损伤修复的适宜微环境因素之一。第二部分督脉电针对移植入受损伤脊髓的预诱导骨髓间充质细胞（MSCs）存活及其分化的影响目的探讨体外用NT-3和RA联合诱导MSCs中内源性TrkC基因的表达及其向神经细胞(neural cells)分化的可能性，并观察督脉电针对移植入受损伤脊髓的预诱导骨髓间充质细胞(MSCs)存活及其分化的影响。方法从7~10天绿色荧光SD大鼠乳鼠的股骨中收集全骨髓细胞，体外培养，通过传代使MSCs纯化，取第3～5代MSCs种植于明胶海绵圆柱体支架中。体外NT-3+RA+MSCs组（应用外源性NT-3和RA联合诱导MSCs）作为实验组，同时设立MSCs组（未诱导的MSCs）、RA+MSCs组（应用RA诱导MSCs）和NT-3+MSCs组（应用NT-3诱导MSCs）作为对照组。7天后应用Real-time PCR技术检测各组MSCs中TrkC mRNA的表达水平，用原位杂交和琼脂糖凝胶电泳的方法在RNA水平上进行验证。用Western blot的方法和免疫荧光组织化学染色三维重构的方法检测NT-3+RA+MSCs组中TrkC蛋白的表达。部分材料在诱导7天后固定,冰冻切片，进行免疫荧光组织化学染色。免疫双标法：TrkC/NF200、TrkC/APC和TrkC/GFAP检测TrkC阳性MSCs向神经细胞的分化。用Real-time PCR技术检测NT-3+RA+MSCs组内源性TrkC基因在诱导不同时间点上的表达，从而确定TrkC基因表达的峰值，并在峰值时检测TrkC蛋白的表达，从而确定移植的时间点。全横断大鼠T10脊髓节段，并且切除2mm脊髓组织。然后将体外种植在明胶海绵圆柱体支架上经NT-3和RA预诱导的MSCs移植到脊髓损伤区，术后NR-MSCs+EA组（移植NT-3和RA联合预诱导的MSCs后给于电针治疗）大鼠在术后第1d开始接受隔日1次的督脉电针治疗，NR-MSCs组（单纯移植NT-3和RA联合预诱导的MSCs）大鼠不进行电针治疗。30天后，将动物灌注固定、取材、组织切片，进行免疫荧光组织化学染色。双标染色有：TrkC/GFP、NF200/GFP、NG2/GFP、GFAP/GFP， Hoechst33342复染核。染色后在普通荧光显微镜下观察并拍照，比较NR-MSCs+EA组和NR-MSCs组中移植细胞的NF200、NG2和GFAP阳性细胞数和GFP阳性细胞总数，从而判断移植细胞的存活和向神经细胞的分化情况。结果与其它组相比，NT-3+RA+MSCs组MSCs中内源性TrkC mRNA表达最高。琼脂糖凝胶电泳结果显示：PCR扩增出TrkC mRNA的cDNA片段出现在相应参照物的位置上。在NT-3+RA+MSCs组中还用原位杂交的方法验证，结果表明：部分MSCs中有TrkC mRNA存在的。Western blot结果显示：除MSCs组中没有TrkC蛋白表达外，其它3组的MSCs都有TrkC蛋白表达。应用激光扫描共聚焦显微镜三维重构技术显示：到第7天，有些MSCs表达的TrkC蛋白定位于近细胞膜处。在诱导7天后，NT-3+RA+MSCs组中部分表达TrkC的MSCs向神经元样细胞和少突胶质样细胞分化；但是，没有观察到MSCs向星形胶质样细胞的分化。当观察NT-3和RA联合诱导MSCs中TrkC mRNA浓度的动态变化时发现：诱导3天后峰值出现，并且在此时用免疫荧光化学染色的结果也证明MSCs中已经有TrkC蛋白表达，因此我们选择在此时将预诱导的细胞移植入脊髓损伤处。当移植到体内并用督脉电针治疗30天后，免疫荧光化学染色的结果显示：两组中都可以看到移植的预诱导的MSCs中TrkC蛋白的持续表达，与NR-MSCs组相比，在NR-MSCs+EA组中移植的预诱导MSCs有更高的存活率并且NF200阳性细胞比例也明显增高(P <0.05)，但NG2的阳性比例下降(P <0.05)。GFAP阳性的细胞在两组中都基本不能检测到。结论体外NT-3和RA联合诱导MSCs时，可以促进其TrkC的表达并向神经细胞方向分化；当督脉电针与预诱导的MSCs移植联合应用时，可以促进其在损伤区的存活和向神经元样细胞的分化。