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目的:1.建立人血液、尿液、唾液中地西泮(DZ)及其代谢物的固相萃取(SPE)和高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS-MS)检出方法;2.研究DZ及其代谢物(I、II相)在人体内的药动学规律,建立DZ的药物动力学模型、方程和参数;探讨血液、尿液以及唾液中DZ的检出时限。3.研究DZ及其代谢物与用药时间之间的关系,建立DZ用药时间的推断方法。方法:1.受试者:中国太原地区志愿者28名,男女各半,年龄22-26岁。所有参与者都无烟酒嗜好,无心、肝、肺、肾脏疾病史及其它慢性病,且在受试前半月内未接触任何药物。参与者均接受试验前教育,并签署知情同意书。2.标本采集:参与者禁食12小时后,于第二日清晨空腹口服含量为5mg的DZ(北京益民药业有限公司)。分别在服药前及服药后的1、2、4、8、12、24小时及2、3、6、12、15天采集肘静脉血各5毫升,唾液、尿液适量,-20℃冰箱保存待检。3.提取检测:生物样品中添加舒乐地西泮(内标)10ng后采用SPE法提取,HPLC-MS-MS法检测,MRM记录方式,保留时间以及定性离子对定性,内标法结合工作曲线法进一步定量。4.数据处理方法:Win Nonlin药代动力学软件;SPSS13.0统计软件,采用t检验和方差分析。结果:1.样品检测:HPLC-MS-MS可同时定量测定DZ、去甲西泮(DMDZ)、去甲羟基地西泮(OZ)、去甲羟基西泮葡萄糖醛酸苷(OG)和羟基西泮葡萄糖醛酸苷(TG)。DZ及其Ⅰ相代谢物DMDZ的最低检测限为0.01ng/m L,线性范围为0.1-100ng/m L;Ⅰ相代谢物OZ最低限测线为0.02ng/m L,线性范围为0.5-100ng/m L;Ⅱ相代谢产物最低检测限为0.5ng/m L,线性范围在0.5-100ng/m L。相关系数r值均大于0.99,RSD小于20%,回收率达84.9%-106%。2.药物动力学:口服5mg DZ后,人血中DZ的代谢物检出均晚于原体,其检出时限分别为小于1h~大于15d。DZ和DMDZ的检测时限长达半个月以上,明显长于OZ、OG和TG;尿液中可以检测到DZ、DMDZ、OG和TG(未检出OZ),其检测时限大致相同,均大于15d。唾液中仅检测到DZ和Ⅰ相代谢物DMDZ,二者检测时限一致,均为6d~大于15d,个体差异明显。DZ原体在血液中药物动力学的过程符合一级吸收二室开放模型,各个时相的半衰期(吸收相、分布相和消除相)分别为0.3±0.4h、9.9±13.6h、和37.2±23.4h;其代谢物DMDZ在血、尿以及唾液中的药物动力学过程均符合一级吸收一室模型,吸收相半衰期、消除相半衰期分别为38.4±26.9h和239.1±289.4h。OG和TG在尿液中药物动力学过程符合一级吸收一室模型,吸收相半衰期和消除相半衰期分别为35.3±32.5h、234.0±265.1h和3.9±5.2h、7029.4±32137.7h。代谢物OZ在所有时相的浓度相对较低,其均数无明显的药时规律。结果发现DZ及其代谢物药物动力学规律具有明显个体差异性,这可能与参与其体内过程的细胞色素P4502C19(CYP2C19)基因型有关系。3.服药时间的推断:应用原药与代谢物浓度比值与服药时间拟合,建立推算DZ服药时间的回归方程,尤其是应用血液中DZ/DMDZ按性别分组与服药时间拟合曲线,不仅相关系数好,而且多数推算值与实际服药时间的误差小于20%。结论:1.本试验构建了同步提取和测定人血液、尿液、唾液内DZ及其代谢物的SPE-HPLC-MS-MS检测方法,LOQ、线性范围、回收率均达药物动力学研究要求,可服务于DZ及其代谢物的法医毒物动力学探讨和DZ中毒案件的法医学鉴定工作。2.本试验建立了DZ及其代谢物的代谢动力学研究模型,首次研究了DZ及I、II相代谢物在中国人血、唾液和尿液中的药物动力学,药物原体可用一级吸收二室开放模型描述,DMDZ可用一级吸收一室模型描述,可为DZ的临床药物监测、DZ中毒诊断或者DZ相关法医学鉴定提供依据。3.本试验初步建立了DZ服药时间的推断方法,根据DZ及其代谢物的比值可大致推断服药时间,为DZ(中)毒死案件法医鉴定中服药时间推测提供实验依据。