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基质金属蛋白酶(MMPs)在卵泡发生、发育、排卵和黄体形成等生物过程中发挥着重要的功能。TIMP3作为MMPs的抑制剂可能参与卵泡周期中各生命活动间的相互协调,而关于TIMP3在奶山羊卵泡中是否表达,表达规律如何,表达调控信号通路及其表达产物调节卵泡激素合成和颗粒细胞凋亡的分子机制等方面的研究,尚未见报道。本研究以关中奶山羊卵泡及其颗粒细胞为研究对象,在克隆和分析TIMP3基因cDNA序列的基础上,分析TIMP3在卵泡周期中的表达规律,探究LH/hCG和mi RNA对TIMP3基因表达、TIMP3基因表达产物对卵泡激素合成、胞外基质重构和颗粒细胞凋亡等生物过程相关基因表达的分子调控机制,以及TIMP3基因表达产物对颗粒细胞凋亡的影响,阐明TIMP3基因在卵泡周期中的生物功能,主要获得以下研究结果:1.TIMP3基因cDNA的克隆及其序列的生物信息学分析采用RACE技术从奶山羊卵巢中获得TIMP3基因的cDNA,通过测序和序列分析发现:奶山羊TIMP3基因cDNA序列全长2208 bp,其中5’非翻译区(5’UTR)长348 bp,CDS区长636 bp(编码211氨基酸的蛋白),3’UTR长1224 bp;预测的氨基酸序列与绵羊、牛、猪、人、小鼠和大鼠的序列的相似度分别为100%、99%、100%、99%、97%和96%;蛋白质结构预测发现其蛋白质由一个N端结构域和一个C端结构域构成,其中每个结构域中包含6个保守的半胱氨酸残基。2.TIMP3基因在奶山羊卵泡周期中的表达规律分析通过Real-time PCR分析发现,TIMP3基因在奶山羊各组织中的表达存在差异,其中在输卵管中的相对表达量最高;在卵泡中,TIMP3基因mRNA的丰度随着卵泡的发育成熟逐渐升高,且在黄体中达到最高;比较分析发现,TIMP3在多羔奶山羊(连续3胎每胎产羔3-4只)卵巢组织中的表达量显著高于单羔奶山羊(连续3胎每胎产羔1-2只),显示TIMP3基因与奶山羊产羔数可能密切相关。3.LH/hCG对TIMP3基因表达的分子调控机制分析采用hCG对培养的颗粒细胞进行处理,Real-time PCR分析发现,TIMP3基因mRNA的丰度分别在处理后4 h和24 h出现峰值;Western Blot分析发现,TIMP3蛋白丰度随着处理时间延长而增加,24 h时达到最大;采用抑制剂进行阻断分析,发现hCG诱导的TIMP3的增加受PKA,PKC,MAPK和PI3K信号通路的影响。进一步对TIMP3基因转录调控区进行分析,发现TIMP3基因上游-1至-122bp的区域内,包含3个Sp1结合位点,定点突变分析,发现-67~-58和-74~-65的突变明显降低TIMP3的转录;采用cAMP激活剂FSK处理颗粒细胞,促进Sp1表达,发现TIMP3转录增强,该结果与EMSA,ChIP以及Sp1过表达和沉默分析相一致,由此确定cAMP通过调节转录因子Sp1来调节TIMP3表达。4.miRNA对TIMP3基因表达的分子调控机制分析依据生物信息学分析的结果,构建荧光素酶报告载体并与miRNAs共转进颗粒细胞中,发现miR-21,miR-221,miR-222和miR-181b均显著的抑制了荧光素酶的活性;采用Real-time PCR分析发现,与NC组相比miR-21和miR-181b显著减少了颗粒细胞中TIMP3基因mRNA的丰度,而miR-221和miR-222组差异不显著;Western Blot分析发现,与NC组相比miR-21,miR-181b,mi R-221和miR-222都显著减少了TIMP3蛋白的丰度,表明miR-21,miR-221,miR-222和mi R-181b与TIMP3基因3’UTR区特异位点结合,调控TIMP3基因的表达,其中miR-21和miR-181b通过促进mRNA降解调节TIMP3基因表达,而miR-221和mi R-222通过抑制翻译调节TIMP3的表达,且miR-21,miR-221,miR-222和miR-181b可促进颗粒细胞的活力。5.TIMP3基因表达产物对颗粒细胞凋亡和激素合成的分子调控机制分析采用腺病毒介导TIMP3基因过表达和siRNA沉默TIMP3基因表达,发现TIMP3基因过表达可抑制颗粒细胞的活力,促进细胞凋亡;TIMP3下调可抑制hCG诱导类固醇激素合成酶StAR,p450scc,HSD3B基因的表达,降低孕酮水平;同时TIMP3抑制ADAM17基因表达,促进ECM蛋白相关基因FN和DCN基因的表达。以上研究表明,LH/hCG与颗粒细胞上的受体LHR结合,激活cAMP信号通路,促进转录因子Sp1表达,Sp1与TIMP3基因Sp1应答元件结合,促进TIMP3基因表达,TIMP3蛋白通过促进StAR,p450scc,HSD3B基因的表达调节孕酮的合成,促进FN和DCN基因表达调节ECM的重构,抑制ADAM17基因表达,抑制颗粒细胞的活力,促进颗粒细胞凋亡参与卵泡周期的调控。这些研究结果,为进一步阐明TIMP3参与调控卵泡周期的分子机理,揭示卵泡发育成熟和排卵的分子调控机制提供理论和试验依据。