基质金属蛋白酶( matrix metalloproteinase, MMPs)是一个蛋白水解酶家族,可降解细胞外基质成分。越来越多的研究表明,基质金属蛋白酶在肿瘤的侵袭、转移中起着重要的作用,而且此作用不仅仅限于它有利于细胞外基质的降解,还对肿瘤微环境的维持和促进肿瘤生长起着重要的作用。　　基质金属蛋白酶又叫基质溶解素。第一个基质金属蛋白酶是在1963年由 Gross和 Lapiere发现的,此后,又有多种基质金属蛋白酶逐渐被发现和表征。根据它们结构和作用底物的特点,基质金属蛋白酶可以分为:胶原酶,明胶酶,基质降解素以及膜型 MMPs等。所有的基质金属蛋白酶都有一些共同的特点,这些特点包括:(1)都含有共同的结构域,包括信号肽与前肽区、催化区、C-端类血红素区和跨膜区;(2)都是以酶原形式分泌;(3)均能够被其他蛋白激酶或有机汞剂激活;(4)酶原激活后伴随着分子量减小;(5)活性中心都含有金属锌离子;(6)它们的活性能被金属蛋白组织抑制剂所抑制;(7)酶原激活后能降解一种或几种细胞外基质成分;(8)这种酶在中性pH环境中发挥作用,并且需要钙离子来维持稳定。　　基质金属蛋白酶的催化区包含一个高度保守的锌结合区,其氨基酸序列为His-Glu-X-Gly-His-X-X-Gly-X-X-His,锌离子作为活性中心和序列中的三个His残基配位结合。序列中的Glu残基在蛋白水解时能提供质子并催化反应进行,同时使锌离子与配位水分子结合更加稳定。　　由于基质金属蛋白酶活性中心中含有三个高度保守的His序列,该活性中心应该非常容易通过 His咪唑环上 N原子与多种金属离子发生配位。因此,合成该酶的催化活性中心肽段,对于模拟研究基质金属蛋白酶活性中心的结构、性质与功能关系及该酶抑制剂的设计合成都有重要意义。本文中采用 Fmoc(9-芴甲氧羰基)固相多肽合成法,合成了两种天然基质金属蛋白酶的活性中心作为研究对象。主要工作如下:　　一、基质金属蛋白酶活性中心肽段的合成、纯化及表征。采用Fmoc-L-Thr(tbu)-Wang树脂作为固相载体,利用Fmoc(9-芴甲氧羰基)基团作为α-氨基保护基,经去保护、活化耦合、洗涤和裂解等步骤合成了两种基质金属蛋白酶的活性中心肽段,即Ala-His-Glu-Phe-Gly-His-Val-Leu-Gly-Leu-Gln-His-Thr(简称P13肽)和Ala-Ala-His-Glu-Leu-Gly-His-Ser-Leu-Gly-Leu-Ser-His-Ser-Thr(简称P15肽)。P13肽和P15肽的分析和纯化在HPLC上进行。粗肽溶解于纯水中,在分析型色谱柱上进行分析(250×4.6mm,5μm,流速1ml/min;流动相A,0.1％TFA;流动相B,90%CH3CN+0.1%TFA;UV检测波长214nm;梯度条件:10%-70%B55 min)。根据分析色谱结果,优化条件后在半制备色谱柱上进行纯化(250×10mm,流速4.7ml/min,流动相A,0.1%TFA;流动相B,90%CH3CN+0.1%TFA)。最终纯化出了高纯度的P13肽和P15肽(98.7%P13肽,99.0%P15肽)。　　用电喷雾质谱分别测定了P13肽和P15肽的分子量,与理论分子量吻合。1H NMR数据证实了P13肽和P15肽中特征性官能团的存在。因此验证了P13肽和P15肽合成和纯化的正确性。这为下一步研究P13肽和P15肽的性质奠定了基础。　　二、核磁共振光谱研究P13肽和P15肽与金属离子的作用。利用一维核磁共振光谱分别对P13肽和P15肽与Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+等金属离子的相互作用进行了研究。实验结果表明,P13肽和P15肽均能与这些金属离子发生配位作用,其作用位点为该活性中心肽段的三个高度保守的His的咪唑环。而且,不同的金属离子对活性中心肽段的结构影响也不尽相同。从核磁谱图可以看出,P13肽和P15肽分别与Cu2+和Co2+作用时,His区域的信号峰明显消失,尤其是与Cu2+作用时更为明显,Cu2+与His咪唑环的N配位后使His咪唑环上N相邻的H信号明显降低或完全消失。而P13肽和P15肽与Zn2+作用时,His区域的H信号仅有较小程度的降低,尤其在高场区变化更小。这说明P13肽和P15肽与Cu2+、Co2+配位能力强于Zn2+,并且与Cu2+和Co2+作用后对其结构的影响也强于Zn2+。　　三、紫外可见吸收光谱研究 P13肽和 P15肽与金属离子的作用。利用紫外可见吸收光谱法分别对P13肽和P15肽与Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+等金属离子的相互作用进行了研究。实验结果表明,P13肽和P15肽与金属离子作用后,其225 nm附近的吸收峰均出现明显增大,这可能是由于肽与金属配位对其酰胺键产生的影响造成的。随着金属离子浓度的增加,225 nm处的吸光度逐渐增大,但当金属离子与肽浓度达到1:1时,225 nm处的吸光度不再变化,这说明P13肽和P15肽与金属离子均为1:1配位结合。当P15肽与Cu2+和Co2+作用时,随着Cu2+浓度的增大,在可见光区出现了新的吸收峰,这是由于Cu2+和Co2+d-d电子跃迁产生的。从P13肽和P15肽与Zn2+作用的紫外光谱中可以看出,Zn2+与肽配位后225 nm处的吸光度变化不大。这也说明了 Zn2+与肽配位对肽本身的结构影响较小,这与核磁共振光谱的实验结果是一致的。　　四、圆二色光谱研究P13肽和P15肽与金属离子的作用。圆二色光谱能快速测定蛋白质和多肽的二级结构,在研究蛋白质和多肽的性质中发挥着重要的作用。酰胺键是用CD谱观察肽和蛋白最重要的发色团,已经确定它有两种迁移方式n-π*迁移通常很弱,在220nm处呈一负带。它的能量(波长)对氢键的形成敏感。π-π*迁移一般较强,在192 nm附近出现一正带,在210 nm处出现一个负带。本文利用圆二色光谱分别对P13肽和P15肽与Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+等金属离子的相互作用进行了研究。结果表明,无论是P13肽还是P15肽与金属离子配位后,均对其二级结构产生了一定的影响。P13肽和P15肽与不同的金属离子作用时对其二级结构的影响也不相同,无论是P13肽还是P15肽与Cu2+作用后对其结构的影响都非常明显,而与Zn2+作用时其构象变化比较小,这也与核磁共振光谱和紫外可见吸收光谱的实验结果是一致的。