【背景】脑卒中是全世界第二大死亡原因,是成年人致残的首要原因。然而,目前针对脑卒中的治疗手段非常有限。对于缺血性脑卒中,目前仅有纤维酶原激活剂(r-t PA)溶栓和机械性溶栓治疗效果肯定,但由于治疗时间窗短(<4.5 h),且存在继发出血风险,仅有不到5%的患者受益于该类药物。因此深入地研究缺血性脑损伤过程中的病理生理机制,探讨有效的药物治疗靶点显得尤为重要。在缺血性脑卒中近数十年的研究过程中,兴奋性毒性作用一直被认为是引起缺血性脑损伤最为核心的理论之一。目前研究发现兴奋性毒性作用与谷氨酸的过度释放、NMDA受体的过度激活以及皮层播散性去极化密切相关。而以上的病理生理过程与细胞是否处于去极化状态密切相关。而细胞是否容易去极化,则往往跟细胞活性有关,细胞活性越低,则细胞越不容易去极化。因此我们推测如果降低神经元的活性尤其是兴奋性神经元的活性可能会减轻缺血性脑损伤中的兴奋性毒性作用。但是事物往往具有两面性。目前研究发现谷氨酸所介导的一些信号途径也参与了缺血性脑损伤后期的修复作用。卒中后某些阶段存在着梗死周边组织的兴奋-抑制失衡,此时促进缺血梗死边缘区皮层神经元的兴奋性可以提高卒中患者的神经功能恢复。因此,我们认为卒中后神经元的兴奋性在缺血不同的阶段扮演着不同的角色。但是目前我们仍然不清楚神经元尤其是兴奋性神经元不同的活性状态在缺血性脑损伤中发生发展的不同阶段所介导的具体作用及机制是什么。【目的】本研究的目的主要包括两部分:1、应用兴奋性神经元特异性过表达内向整流性钾离子通道2.1(Kir2.1)转基因小鼠,探讨兴奋性神经元活性抑制在缺血性脑损伤中不同阶段所介导的具体作用。2、运用转录组测序技术(RNA-seq)技术和生物信息学分析手段探讨兴奋性神经元活性抑制在缺血性脑损伤不同阶段所介导的作用机制。【方法】在本次研究中我们首先将Cam K2a-CreERT2转基因小鼠与本实验室自主构建的Kir 2.1loxp/loxp转基因小鼠进行杂交,经过数代培养,得到Cam K2α-CreERT2/Kir 2.1loxp/loxp和Cam K2α-CreERT2/Kir 2.1-/-转基因小鼠,经过Tamoxifen诱导后,Cam K2α-CreERT2/Kir 2.1loxp/loxp小鼠的兴奋性神经元上将会过表达Kir2.1蛋白,应用q PCR、免疫印迹、免疫荧光、3D重构以及电生理等手段明确我们是否成功构建了兴奋性神经元活性抑制小鼠模型。在成功构建了特异性抑制兴奋性神经元活性的小鼠模型基础上,我们将经过Tamoxifen诱导后的Cam K2α-CreERT2/Kir2.1loxp/loxp(Kir2.1(+))和Cam K2α-CreERT2/Kir 2.1-/-(Kir2.1(-))小鼠随机分为Kir2.1(-)小鼠假手术组(Sham_Kir2.1(-)组);Kir2.1(+)小鼠假手术组(Sham_Kir2.1(+)组);Kir2.1(-)小鼠MCAO(Middle Cerebral Artery Occlusion)手术组(MCAO_Kir2.1(-)组)和Kir2.1(+)小鼠MCAO手术组(MCAO_Kir2.1(+)组)。我们采用大脑中动脉栓塞模型构建小鼠脑缺血模型,磁共振成像(MRI)检测小鼠在脑缺血1h再灌注1天及3天后的脑缺血损伤面积;应用FJ染色检测小鼠在脑缺血1h再灌注7天以及14天后的脑缺血区神经细胞死亡数量;在实验过程中我们还统计了小鼠的死亡率以及术后小鼠体重增长率;利用改良后的神经系统评分系统(7分制)评估了缺血后小鼠1天,3天和7天的神经功能,并利用转棒实验评估了小鼠在卒中后1天,3天,7天,14天,28天的运动功能的恢复情况。我们应用RNA-seq技术全面检测了Sham_Kir2.1(-)(WC)、MCAO_Kir2.1(-)(WS)组、Sham_Kir2.1(+)(MC)组和MCAO_Kir2.1(+)(MS)组术后1天、3天、7天、14天和28天皮层组织的转录组(每组每个时间点各3个生物学重复样)。我们使用hpp RNA中的Tophat-Cufflink-Cuffdiff流程筛选出WS与MS组小鼠术后1天,3天,7天,14天和28天每个时间点的差异基因,将筛选出的差异基因分别进行GO(Gene Ontology)功能富集分析或KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信号通路富集分析。此外,我们还利用ma Sig Pro R包筛选出时间序列性差异基因。观察MC_MS组(Sham_Kir2.1(+)与MCAO_Kir2.1(+)组相比)和WC_WS组(Sham_Kir2.1(-)与MCAO_Kir2.1(-)组相比)差异基因的表达模式,并将具有特佂时间点的差异基因进行GO功能富集分析,以及KEGG信号通路富集分析。结合以上两种生物信息学分析法,以便明确兴奋性神经元活性抑制在缺血性脑损伤不同阶段所介导的作用机制。根据生信分析的结果,我们对以上四组小鼠,使用比色法检测手术侧脑组织中伊文思蓝的含量,Iba免疫染色评估脑缺血后7天活化小胶质细胞的数量,ELASA法检测术后1天,3天,7天以及14天手术侧脑组织中IL-6、IL-1β以及TNF-α等炎性细胞因子的含量。【结果】成功构建了特异性抑制兴奋性神经元活性的模型小鼠。在此基础上我们发现在缺血1h再灌注1天后,磁共振成像结果表明:与MCAO_Kir2.1(-)组相比,MCAO_Kir2.1(+)组小鼠缺血损伤体积未见明显增大,差异无显著意义(p>0.05)。但是在缺血1h再灌注3天后,磁共振成像结果表明MCAO_Kir2.1(+)组小鼠缺血损伤体积要明显大于MCAO_Kir2.1(-)组小鼠,差异具有显著性(p<0.01);FJ染色结果显示在小鼠脑缺血7天和14天后,与MCAO_Kir2.1(-)组小鼠相比较,MCAO_Kir2.1(+)组小鼠的FJ阳性细胞数明显增多(p<0.01)。我们还发现在MCAO术后7天内,MCAO_Kir2.1(-)组小鼠死亡率为0,而MCAO_Kir2.1(+)组小鼠死亡率高达57%,并且存活的MCAO_Kir2.1(+)组小鼠的体重的恢复要晚于MCAO_Kir2.1(-)组小鼠;神经评分结果显示MCAO_Kir2.1(+)组的小鼠在MCAO术后的第1天,第3天和第7天神经评分均高于MCAO_Kir2.1(-)组小鼠;转棒实验结果显示:在我们监测的各个时间点内卒中后Kir2.1(+)小鼠在转棒上停留的时间均短于Kir2.1(-)小鼠。以上结果表明兴奋性神经元活性抑制在缺血1h,再灌注1天之后会逐渐加重小鼠缺血性脑损伤,延缓小鼠神经功能恢复。根据RNA-seq数据,使用hpp RNA中的Tophat-Cufflink-Cuffdiff流程筛选出MCAO_Kir2.1(-)与MCAO_Kir2.1(+)组小鼠术后1天、3天、7天、14天、28天每个时间点的差异基因各为28、91、350、275以及50个差异基因。通过GO生物学功能聚类及KEGG通路富集分析,我们发现在MCAO后3至14天,MCAO_Kir2.1(+)组小鼠的炎症以及免疫反应程度圴要强于MCAO_Kir2.1(-)组。此外,我们还发现在MCAO术后7天,MCAO_Kir2.1(+)组小鼠与神经功能恢复的基因通路呈下调状态。利用ma Sig Pro R包筛选出的时间序列性差异基因在MC_MS组有1938个,在WC_WS组有1731个,两者共有差异基因有1402个。对这两组时间序列性差异基因进行了7个群集的分类后我们发现这两组差异基因表达模式有很大的不同,主要表现在WC_WS组有54.5%的基因其表达高峰期在MCAO后7天,而在MC_MS组有73.1%的基因其表达高峰期在MCAO后14天,以及WC_WS组有173个基因表达高峰期在MCAO后1天,但基本上无表达高峰期在第3天的差异基因,而在MC_MS组有246个基因其表达平台高峰期是在MCAO后1~3天。对这两组具有特佂时间点的差异基因进行GO功能富集分析,以及KEGG信号通路富集分析我们发现与WC_WS组相比,MC_MS组的差异基因中与炎症以及免疫反应相关的基因表达持续时间长,且程度强烈。我们还发现MC_MS组表达高峰期在MCAO后7天的93个基因中有58个基因是Kir2.1(+)小鼠在缺血性脑卒中后所特有的差异基因。而这些差异基因主要与细胞周期以及DNA代谢复制关。此外,我们还发现在MC_MS组中表达下调的时间序列差异基因中与神经功能恢复的相关基因也呈持续抑制状态。另一方面,Kir2.1(+)小鼠在MCAO后3天,缺血侧脑组织中伊文思蓝的含量要明显高于Kir2.1(-)小鼠。在MCAO后7天,Kir2.1(+)小鼠活化的小胶质细胞数量也明显高于Kir2.1(-)小鼠。炎性细胞因子TNF-α在Kir2.1(+)小鼠脑缺血后3天、7天以及14天的蛋白差异表达倍数要明显高于Kir2.1(-)小鼠;IL-6以及IL-1β是在脑缺血后7天以及14天的的蛋白差异表达倍数高于Kir2.1(-)小鼠。【结论】兴奋性神经元过表达Kir2.1通道蛋白导致兴奋性神经元活性抑制。兴奋性神经元活性抑制可以加重小鼠缺血性脑卒中亚急性期的损伤,促进神经元死亡,延缓小鼠缺血性脑卒中后神经功能的恢复。而这与兴奋性神经元活性抑制改变了缺血性脑卒中后基因表达模式,加重了缺血后炎症以及免疫反应,促进神经元细胞周期紊乱,并持续性抑制与神经功能恢复相关基因表达有关。