[目的]骨肉瘤好发于儿童和青少年,具有高度侵袭性及转移性,预后较差。因此,有必要开发新的药物或治疗方案以提高临床治愈率。奥科呋喃(C18H17NO6,6-乙酰-2-(1-氨基乙基)-7,9-二羟基-8,9b-二甲基-9bH-二苯丙呋喃-1,3-二酮)是从松萝中提取的二苯丙呋喃类化合物。本研究通过体外人骨肉瘤细胞的培养和体内裸鼠异种移植瘤模型的建立,探究奥科呋喃对人骨肉瘤细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响和可能涉及的分子机制,为奥科呋喃的体内实验安全疗效观察甚至临床实验提供重要的理论依据。[方法](1)常规培养人骨肉瘤细胞 MNNG/HOS C1#5[R-1059-D](KCB2016037YJ,中科院昆明动物所细胞库)、人骨肉瘤细胞Saos-2(KCB200550YJ,中科院昆明动物所细胞库)。(2)CCK-8 检测 0 μM、0.15625 μM、0.3125 μM、0.625 μM、1.25 μM、2.5μM、5 μM、10μM、100 μM奥科呋喃作用于MNNG细胞和Saos-2细胞24 h、48 h、72 h 后的细胞存活率;CCK-8 检测 0 μM、0.15625μM、0.3125 μM、0.625μM、1.25 μM、2.5 μM、5 μM、10 μM、100 μM 顺铂作用于 MNNG 细胞 48 h后的细胞存活率。以下实验分组为:奥科呋喃0 μM组、奥科呋喃1.5 μM组、奥科呋喃3 μM组、奥科呋喃4 μM组。(3)流式细胞术、TUNEL染色检测不同浓度奥科呋喃作用于MNNG细胞48 h后的细胞凋亡率。(4)划痕实验和Transwell小室实验检测不同浓度奥科呋喃作用于MNNG细胞48 h后对细胞迁移和侵袭的影响。(5)ELISA检测不同浓度奥科呋喃作用于MNNG细胞48 h后对MMP-2、MMP-9、VEGF分泌的影响。(6)免疫印迹检测经不同浓度奥科呋喃处理48 h后MNNG细胞中PCNA、Ki67、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、MMP-2、MMP-9、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT 的蛋白表达水平。(7)qRT-PCR检测经不同浓度奥科呋喃处理48 h后MNNG细胞中PCNA、Ki67、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、MMP-2、MMP-9、VEGF 的 mRNA表达水平。引入PI3K/AKT信号通路激动剂740Y-P和PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002后的实验分组为:奥科呋喃0 μM组、740Y-P 20 μM组、奥科呋喃4 μM组、奥科呋喃4μM+740Y-P 20μM组、LY294002 20 μM组、奥科呋喃4 μM+LY294002 20μM组。实验方法同上。(8)裸鼠异种移植骨肉瘤模型建立取0.2 ml 5×1 06个/ml对数生长期MNNG细胞悬浮液于裸鼠右侧背部皮肤注射,SPF级饲养。当肿瘤体积达到180-200 mm3时,将裸鼠随机分为对照组和实验组,每组3只。实验组给予2 mg/kg奥科呋喃,腹腔注射,每天一次;对照组按相同剂量和给药方式注射0.9%生理盐水。(9)瘤体体积、裸鼠体重、肝肾功能监测裸鼠成瘤后,每3天记录裸鼠体重、瘤体体积。裸鼠将在给药第20天以颈椎脱臼法处死。处死裸鼠前,尽可能多的收集裸鼠球后静脉血,检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肌酐(CREA)、尿素氮(UREA)的水平。(10)生物学检测解剖下来的瘤体分成两部分,一部分保存于10%中性福尔马林溶液中,用于HE染色、TUNEL染色和IHC染色;一部分提取蛋白后用于免疫印迹检测;剩余部分-80℃冰箱保存。(11)二代高通量测序采用二代高通量测序检测经3 μM奥科呋喃处理48 h后、MNNG细胞中差异表达的miRNA,并经qRT-PCR验证。(12)质粒构建构建与转染根据二代高通量测序和qRT-PCR验证结果,以miR-16-5p序列为模板,构建过表达 LV-miR-16-5p mimics 和抑制表达 LV-miR-16-5p inhibitor 载体,转染MNNG细胞,以空载质粒LV-NC作为对照。实验分组为:对照组3μM奥科呋喃+MNNG细胞、阴性对照组3μM奥科呋喃+LV-NC细胞、3μM奥科呋喃+LV-miR-16-5p mimics细胞、3 μM奥科呋喃+LV-miR-16-5p inhibitor 细胞。(13)MNNG细胞生物学行为检测稳转细胞株经3μM奥科呋喃处理48 h后检测细胞存活率、凋亡率、侵袭和迁移等的变化。[结果](1)奥科呋喃可抑制人骨肉瘤MNNG细胞和Saos-2细胞增殖CCK-8结果示,奥科呋喃对MNNG细胞和Saos-2细胞的增殖抑制作用呈时间-剂量依赖性;奥科呋喃对MNNG细胞的抑制作用优于顺铂;奥科呋喃显著下调MNNG细胞的PCNA和Ki67的蛋白及mRNA表达水平。确定后续实验对象为MNNG细胞,奥科呋喃实验浓度为1.5μM、3 μM、4μM。(2)奥科呋喃诱导人骨肉瘤MNNG细胞凋亡且呈剂量依赖性流式细胞术和TUNEL染色结果示,奥科呋喃呈剂量依赖性诱导MNNG细胞凋亡;免疫印迹结果示,奥科呋喃显著上调Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9的蛋白表达水平,显著下调Bcl-2的蛋白表达水平;qRT-PCR结果示,奥科呋喃显著下调Bcl-2、Caspase-3的mRNA表达水平。(3)奥科呋喃抑制人骨肉瘤MNNG细胞迁移和侵袭划痕实验和Transwell小室实验结果示,奥科呋喃显著下调MNNG细胞迁移和侵袭能力;免疫印迹结果示,奥科呋喃显著下调MMP-2、MMP-9、N-cadherin、Vimmentin的蛋白表达水平,显著上调E-cadherin的蛋白表达水平;ELISA结果示,奥科呋喃显著下调MMP-2、MMP-9、VEGF的分泌。(4)奥科呋喃抑制PI3K/AKT信号通路活性免疫印迹结果示,奥科呋喃显著下调p-PI3K和p-AKT的蛋白表达水平,但不影响总PI3K和总AKT的蛋白表达水平。(5)奥科呋喃通过抑制PI3K/AKT信号通路发挥抗骨肉瘤作用CCK-8结果示,奥科呋喃和740Y-P共同孵育作用于MNNG细胞后,细胞存活率较奥科呋喃组有显著的提高;流式细胞术结果示,奥科呋喃和740Y-P共同孵育作用于MNNG细胞后,细胞凋亡率较奥科呋喃组显著降低;免疫印迹结果示,奥科呋喃和740Y-P共同孵育作用于MNNG细胞后,显著削弱了 740Y-P对 MMP-2、MMP-9、N-cadherin、Vimentin、p-PI3K 和 p-AKT 蛋白的上调作用;在E-cadherin的蛋白表达水平检测中,我们得到了与之相反的实验结果;LY294002显著下调p-PI3K和p-AKT的蛋白表达水平;奥科呋喃和LY294002共同孵育作用于MNNG细胞后,增强了对p-PI3K和p-AKT蛋白的下调作用。(6)奥科呋喃抑制裸鼠移植瘤的生长,但不影响裸鼠体重和肝肾功能从时间-肿瘤体积曲线得出,给药组瘤体体积明显小于对照组;从时间-裸鼠体重曲线得出,给药组裸鼠体重无明显变化;肝肾功能检测示,给药组裸鼠ALT(U/L)、AST(U/L)、CREA(μmol/L)水平较对照组显著下调。(7)奥科呋喃抑制瘤体肿瘤细胞增殖,诱导细胞凋亡HE染色示,给药组瘤体组织染色较对照组细胞结构不清,细胞核固缩、深染、分裂,坏死率明显增加;TUNEL染色示,给药组瘤体组织发生凋亡的细胞数量明显高于对照组;IHC染色示,给药组瘤体组织中PCNA和Ki67的蛋白表达量明显低于对照组。(8)奥科呋喃抑制EMT和PI3K/AKT相关蛋白的表达奥科呋喃可显著下调瘤体中p-PI3K、p-AKT、N-cadherin、Vimentin的蛋白表达水平,上调E-cadherin的蛋白表达水平。(9)奥科呋喃对MNNG细胞中miR-16-5p的表达呈正调控二代高通量测序结果示,MNNG细胞经奥科呋喃处理后共12个miRNAs差异具有统计学意义(p<0.05);经qRT-PCR验证后miR-16-5p的表达水平显著上调,与测序结果一致。(10)miR-16-5p功能获得上调奥科呋喃对MNNG细胞增殖的抑制作用CCK-8结果示,与对照组和阴性对照组相比,3 μM奥科呋喃+LV-miR-16-5p mimics组MNNG细胞存活率显著下调,3μM奥科呋喃+LV-miR-16-5p inhibitor组MNNG细胞存活率显著上调;免疫检测结果示,3μM奥科呋喃+LV-miR-16-5p inhibitor组Ki67和PCNA的蛋白表达水平上调。(11)miR-16-5p功能获得上调奥科呋喃诱导MNNG细胞凋亡的能力流式细胞术结果示,3 μM奥科呋喃+LV-miR-16-5p mimics组细胞凋亡率显著上调,3 μM奥科呋喃+LV-miR-16-5p inhibitor组细胞凋亡率显著下调;免疫检测结果示,3μM奥科呋喃+LV-miR-16-5p imics组Bax、Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9 的蛋白表达水平上调;3 μM 奥科呋喃+LV-miR-16-5p inhibitor组 Bax、Cleaved Caspase-3 和 Cleaved Caspase-9 的蛋白表达水平下调,Bcl-2 的蛋白表达水平上调。(12)miR-16-5p功能获得上调奥科呋喃对MNNG细胞侵袭和迁移的抑制作用划痕实验和Transwell小室实验结果示,3 μM奥科呋喃+LV-miR-16-5p inhibitor组MNNG细胞迁移和侵袭能力显著上调;免疫检测结果示,3 μM奥科呋喃+LV-miR-16-5p mimics组E-cadherin的蛋白表达水平上调;3 μM奥科呋喃+LV-miR-16-5p inhibitor 组 E-cadherin 的蛋白表达水平下调,N-cadherin 和Vimentin的蛋白表达水平上调。(13)miR-16-5p功能获得上调奥科呋喃对PI3K/AKT信号通路的抑制作用免疫检测结果示,3 μM奥科呋喃+LV-miR-16-5p mimics组p-AKT和p-P13K的蛋白表达水平下调。[结论](1)奥科呋喃可抑制MNNG细胞增殖、侵袭和迁移,诱导细胞凋亡;奥科呋喃通过抑制PI3K/AKT信号通路发挥其抗骨肉瘤作用;(2)奥科呋喃可显著抑制裸鼠异种移植瘤的生长,但不影响裸鼠体重和肝肾功能;(3)奥科呋喃可上调MNNG细胞中miR-16-5p的表达水平;miR-16-5p功能获得可上调奥科呋喃对MNNG细胞的增殖、迁移和侵袭以及PI3K/AKT信号通路的抑制作用和奥科呋喃诱导MNNG细胞凋亡的能力。