抗菌肽是由生物细胞特定基因编码,经过外界条件诱导产生的一类具有广谱杀菌活性作用的多肽。近年来发现的新型抗菌肽hepcidin,在鱼类中广泛存在,主要是由生物体肝脏特异性表达的一种阳离子小分子多肽。可以抑制多种病毒、细菌、真菌和原生动物的生长繁殖,在鱼类非特异性免疫中起重要作用,同时也可以作为一种信号分子,参与机体铁代谢。本研究根据Gen Bank登录的已知鱼类抗菌肽hepcidin基因的保守区设计简并引物,采用RT-PCR结合RACE的方法获得淇河鲫(Qihe crucian carp Carassius auratus)hepcidin基因全长c DNA序列,并对基因序列及其编码的多肽进行了结构和系统进化分析。得到淇河鲫hepcidin c DNA全长708 bp,包含开放阅读框(ORF)258bp,5′非翻译区(5′-UTR)94 bp和3′非翻译区(3′-UTR)356 bp,其中3′-UTR存在1个多聚腺苷酸加尾信号(AATAAA)和2个m RNA不稳定基序(ATTTA)。开放阅读框编码一个85个氨基酸的成熟肽前体,由信号肽(24个氨基酸残基)、前体肽(36个氨基酸残基)和成熟肽(25个氨基酸残基)3部分序列组成。成熟肽含有8个保守的半胱氨酸残基,通过4个链内二硫键形成单一发卡结构,拐角处有一个特殊的二硫键,可能与hepcidin的抗菌活性直接相关。序列分析表明,与已报道的其他鱼类hepcidin相比较,核苷酸序列具有很高的序列相似性,翻译的成熟肽与其他种类生物的成熟肽进行系统进化分析,结果显示与报道的其他鱼类hepcidin具有较高的同源性,且与鲤鱼的亲缘关系最近,而与哺乳类和两栖类在不同的分支上。采用RT-q PCR的方法检测淇河鲫不同组织hepcidin m RNA表达水平,以及腹腔注射嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和脂多糖(LPS)后各组织的表达变化,结果显示在正常淇河鲫中,肝脏中hepcidin m RNA表达水平最高,其次为脾脏和头肾,在鳃和肾中的水平较低,而在心脏、肠、肌肉、脑和血液中m RNA的表达量则更少。淇河鲫经过嗜水气单胞菌注射和LPS刺激后,选取hepcidin m RNA表达量较高的五种组织(鳃,肾脏、脾脏、肝脏、头肾)检测表达的时序变化。结果显示整体水平呈先升高再下降的趋势,但不同组织的表达模式也有不同。注射LPS的鱼体中,头肾、肾脏和脾脏hepcidin m RNA水平在刺激后6 h达到最大值,可达到对照组水平的100多倍;鳃中hepcidin m RNA水平在刺激后12 h达到最大值,约为对照组水平的60倍;肝脏hepcidin m RNA水平在刺激后3 h开始上升,到24 h才达到最高,约为对照组的30倍,之后慢慢回落。注射嗜水气单胞菌的鱼体中,脾脏在6 h达到最高,hepcidin m RNA水平约为对照组的150倍;鳃、肾脏、头肾在12 h达到最高,鳃和肾hepcidin m RNA水平约为对照组的80倍,头肾为150倍;肝脏在24 h达到最高,约为对照组hepcidin m RNA水平的18倍。腹腔注射生理盐水对照组鱼的hepcidin m RNA水平显示变化幅度不大。构建原核表达载体p ET32a(+)~hepcidin,转化入大肠杆菌BL-21中经IPTG诱导表达,然后对表达产物进行SDS-PAGE电泳检测。结果显示在细菌裂解液的上清和包涵体沉淀中均存在一条分子量21 k D的特异性条带,与hepcidin融合蛋白预期的分子量(21.72k D)大小基本一致。且在IPTG诱导8 h左右时表达量最高,对后续的蛋白纯化及抗菌活性检测实验提供了参考依据。