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目的:肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,长期居于癌症相关致死率的首位。其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌中最常见的类型,约占85%。尽管外科手术是NSCLC的首选治疗,但术后仍有较高复发率,而且大部分中晚期NSCLC失去手术机会,因此多疗程化疗是决定患者生存期限的重要辅助治疗手段。以顺铂(Cisplatin,CDDP)为核心化疗方案的快速耐药是预后不良的重要原因。因而,探索有效辅助治疗方案成为延长患者生存率和改善患者预后的关键。顺铂主要通过形成顺铂-DNA复合体,激活DNA损伤,进而诱导肿瘤细胞凋亡;顺铂诱导恶性肿瘤细胞发生程序性死亡的另一个重要机制就是上调细胞内的活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,破坏细胞内稳态,造成氧化应激(oxidative stress),氧化/抗氧化失衡,从而诱导肿瘤细胞凋亡。以肺腺癌为代表的多种肿瘤细胞存在凋亡通路信号转导障碍、抗凋亡蛋白被激活以及受到多药耐药基因高表达的影响,对凋亡机制的耐药十分明显,以往大多针对信号转导障碍靶点研发新药或者多种化疗药物联合应用,来解决原发性和继发性凋亡抵抗,以此提高化疗药物介导的肿瘤细胞凋亡水平。遗憾的是,由于凋亡通路存在极其完整的互补代偿机制不易长时间被小分子药物所抑制或激活,加之联合应用多种化疗药物所引发的人体难以耐受的副作用等问题,导致这方面的探索始终未能取得较大进展。诱导肺腺癌顺铂耐药细胞发生非凋亡性死亡是克服顺铂抵抗的新策略。Nrf2是抗氧化系统的主要调控因子,表达大量抗氧化基因,在抗氧化防御起到重要作用。在相当比例的肺腺癌中,由于Nrf2的抑制因子Keap1存在变异,导致Nrf2持续活化,参与其对化疗药物的抵抗性。但是Nrf2/ARE具体的下游基因如xCT尚未确定,是否参与肺腺癌顺铂抵抗尚不明确。另外,最近被报道的铁死亡(ferroptosis)是一种铁依赖的非凋亡性细胞死亡形式,铁死亡发生的本质是由脂质活性氧(lipid reactive oxygen species,lipid ROS)在胞浆中蓄积而诱发的一种具有铁离子依赖性的程序化细胞死亡,最显著的细胞亚显微结构改变是透射电子显微镜下线粒体内膜缩小。细胞发生铁死亡最直观的特征是不能被程序性坏死、凋亡、以及坏疽的小分子抑制剂Nec-1(necrostatin-1,坏死稳定素1)、BOC-D-FMK和Z-VAD-FMK阻断;但可以特异性地被铁离子螯合剂deferoxamine(DFO,去铁胺)、及亲脂性抗氧化剂vitamin E(Vit-E),ferrostatin-1(Fer-1)所抑制。而铁死亡的诱导机制之一就是抑制xCT对胱氨酸向细胞内转运,靶向阻断xCT通过阻断胱氨酸摄取导致谷胱甘肽耗竭,并使癌细胞对化疗剂敏感。xCT抑制剂包括小分子化合物Erastin、Sorafenib。遗憾的是,肺腺癌铁死亡的研究尚处空白。综上所述,本实验需要证实:(1)Nrf2/xCT通路活化是否参与肺腺癌顺铂耐药;(2)抑制xCT是否提高顺铂耐药的肺腺癌细胞对顺铂敏感性;(3)抑制xCT是否诱导肺腺癌顺铂耐药细胞发生铁死亡。研究方法:1、CCK-8方法测定不同浓度顺铂干预下的肺腺癌细胞系和腺癌组织标本原代培养细胞的存活率。2、RT-qPCR方法测定顺铂干预后肺腺癌细胞系和腺癌组织标本原代培养细胞中Nrf2,xCT,HO-1和NQO1的mRNA表达水平。3、Western blotting测定顺铂干预后NSCLC细胞系和腺癌组织标本原代培养细胞中Nrf2,xCT,H0-1和NQO1的蛋白表达水平。4、含ARE双荧光素酶报告基因检测Nrf2和xCT的转录活性。5、在顺铂耐药相对较明显的A549细胞中,我们用转染siRNA的方法敲减了Nrf2和xCT。并用WB验证了siRNA对相应基因的敲减效率。测定对顺铂的敏感性。6、对顺铂相对较为敏感的N5细胞中过表达了Nrf2或xCT,测定对顺铂的敏感性。7、采用H2DCFDA方法测定顺铂干预后细胞ROS产生量。8、将对顺铂相对敏感的N5细胞驯化建立顺铂抵抗细胞系(N5CP)9、N5CP分别经Erastin/Sorafenib,DFO,Vit-E干预后,CCK-8法测定细胞的存活率,PI方法测定细胞的死亡率。10、N5CP细胞种植在裸鼠皮下,分别经顺铂、Erastin或Sorafenib腹腔内注射后,称量肿瘤重量。结果:1、10-80μg/mL顺铂对四种肺腺癌细胞(NCI-H1299,A549,N2和N5,N2和N5来源于外科手术切除的腺癌组织的原代培养细胞)表现出不同的细胞毒性效果。其中,A549细胞对顺铂耐药最明显,而N5细胞对顺铂最敏感。2、A549和N5细胞暴露于20μg/mL顺铂分别作用3-12小时,顺铂上调了Nrf2和其下游靶基因xCT mRNA的表达,并未明显改变HO-1和NQO1的mRNA表达水平。尤其xCT在12小时被显著提高了8.6倍。3、WB结果可以看出顺铂作用下A549细胞暴露于20 to 40μg/mL顺铂12小时后,Nrf2及xCT蛋白表达明显增加,xCT增加尤其显著,与上述mRNA水平结果一致。4、顺铂诱导了ARE双荧光素酶报告基因活性,并且相对于N5细胞,顺铂对A549细胞中Nrf2转录能力活化作用更为显著。5、转染siRNA的方法敲减了Nrf2和xCT的A549细胞,经20μg/mL顺铂处理48小时,细胞的存活率较对照组明显降低(p<0.05),说明敲减Nrf2或xCT的A549细胞对顺铂敏感性显著提高。6、N5细胞中Nrf2或xCT表达水平提高显著降低了顺铂对N5的细胞毒性。7、20μg/mL顺铂作用6小时后,A549和N5细胞内的ROS(reactive oxygen species)水平。结果可以看出,顺铂显著诱导了N5细胞ROS蓄积,说明顺铂敏感的N5细胞内产生ROS多于对顺铂不敏感的A549细胞。8、Erastin 10μM和Sorafenib 20μM大幅降低了N5CP细胞的存活率(p<0.05)。并且,可以被铁死亡特异性抑制剂去铁胺DFO(50μM)及抗氧化剂Vit-E(100μM)显著抑制,说明细胞发生的死亡方式为铁死亡。同时,我们也用PI染色法,检测了Erastin和Sorafenib作用时,细胞的死亡情况。Erastin和Sorafenib明显增加PI染色阳性的N5CP细胞(p<0.05)。9、N5CP细胞种植在裸鼠皮下,分别经顺铂、Erastin或Sorafenib腹腔内注射后,肿瘤重量减轻。结论:1、Nrf2/.xCT通路活化是肺腺癌细胞顺铂耐药的重要机制,其中肺腺癌细胞对顺铂的敏感性与顺铂介导的Nrf2/.xCT通路活化水平呈负相关。Nrf2/xCT表达水平变化改变了肺腺癌细胞对顺铂敏感性。2、抑制xCT可以高效率的诱导顺铂耐药的肺腺癌细胞发生铁死亡。