糖尿病已成为继心血管疾病和肿瘤之后的人类第三大疾病。目前糖尿病患者多采用外源胰岛素来控制血糖水平,但是不可避免会产生低血糖症状。近年来,胰岛移植已经发展成为有望严格控制血糖水平的糖尿病治疗方法。由于供体胰腺的短缺,人们开始寻找胰岛的替代资源,如干细胞、猪胰岛等。胰腺干细胞是存在于胰腺组织中、能自我更新、具有多向分化潜能的一类成体干细胞。胰腺干细胞体外增殖分化为胰岛细胞的途径具有方法简便、成功率高、致瘤风险小和无伦理因素制约等优势,有望率先用于治疗糖尿病。本实验室于2004年建立一株人胰腺干细胞系,但对其生物学特性仅进行了初步检测。本研究以该胰腺干细胞为试验材料,对其表达特征、生长特性、体内外分化能力进行了较为系统的鉴定,以进一步完善其生物学特性的检测;同时将其体外定向诱导分化为胰岛样细胞团并植入糖尿病大鼠模型体内,观察其改善糖尿病症状的效果,旨在为糖尿病的临床治疗研究提供一株背景清楚的种子细胞。本研究主要内容包括:1人胰腺干细胞的生物学特性免疫组化染色结果显示,该胰腺干细胞表达PDX-1、Nestin、CK7、CK19、胰高血糖素、生长抑素、胰多肽、GLUT2、E-钙黏素、波形蛋白、AFP和PCNA,不表达胰岛素和胰淀素;RT-PCR进一步证实细胞转录PDX-1、Nestin、CK7、CK19、GLUT2和β-Gal基因,不转录胰岛素基因;流式细胞仪分析显示,该胰腺干细胞表达CD29、CD44、CD166 ,不表达CD14、CD34、CD45、CD11a、CD90、CD105、CD117。该胰腺干细胞与目前所报道的胰腺干细胞的表达特征基本一致。该胰腺干细胞呈克隆性生长。当培养皿中细胞数较少时,可见多角形的上皮样胰腺干细胞呈典型的单克隆方式生长;当细胞生长至70%融合时,则呈铺路石样。接种培养1～4d,细胞生长缓慢处于潜伏期;5～7d,进入对数生长期;之后生长速度减慢进入平台期。与第30、44代细胞相比,第20代细胞从第6d起生长较快。目前此胰腺干细胞已扩增培养3年。该胰腺干细胞植入裸鼠体内后,在其腹股沟处形成肿块。移植后6周,取肿块做切片。H.E染色,可见细胞在裸鼠体内分化形成的组织含有未成熟的腺泡样结构,而组织部分区域可见坏死细胞,可能是营养缺乏所致。结合PDX-1、Nestin、CK19免疫组化染色阳性结果,提示该胰腺干细胞在体内可自发分化为胰腺来源的细胞。体外采用添加烟酰胺、bFGF与HGF的无血清诱导液诱导干细胞分化为DTZ染色阳性的β细胞;采用β-Me诱导其分化为β-tublin免疫组化染色阳性的神经细胞;采用地塞米松和Vc诱导其分化为甲苯胺蓝染色阳性的软骨细胞;但是应用5-氮胞苷并未将干细胞诱导分化为心肌细胞,提示可能是该诱导条件不适合其向心肌方向分化或该胰腺干细胞分化能力有限。综上,该胰腺干细胞体内可自发分化为胰腺来源的细胞,体外可定向诱导分化为内胚层的胰腺β细胞、中胚层的软骨细胞及外胚层的神经细胞,表明其具备多向分化潜能。2人胰腺干细胞诱导胰岛样细胞团及其治疗大鼠糖尿病采用无血清诱导液将随机解冻的第18代人胰腺干细胞体外诱导分化为胰岛样细胞团,DTZ染色阳性,RT-PCR检测转录胰岛素mRNA,葡萄糖刺激能释放胰岛素。将获得的胰岛样细胞团植入STZ制备的糖尿病大鼠肾背膜下,移植后48h,血糖水平即明显下降,维持约两周时间,但其血糖浓度仍高于正常血糖浓度范围;移植后第3周血糖浓度迅速上升,之后一直维持高血糖状态。与胰岛样细胞团移植组大鼠相比,糖尿病对照组大鼠血糖浓度一直处于糖尿病血糖浓度范围内。初步证实人胰腺干细胞体外诱导分化的胰岛样细胞团具有一定的抗大鼠糖尿病作用。