论文部分内容阅读
猪链球菌病是由多种不同群的链球菌所引致猪传染病的总称。其中,猪链球菌(Streptococcus suis,SS)是世界范围内引致猪链球菌病最主要的病原,也是一种重要的人兽共患病原菌。根据SS荚膜抗原特性的差异,可将其分为35个血清型(1-34 型和 1/2 型),其中以猪链球菌 2 型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)临床分离率最高且致病性最强,不仅给养猪业造成了巨大的经济损失,同时也给公共卫生带来了威胁及挑战。疫苗免疫接种是预防和控制猪链球菌病的有效措施,但由于SS血清型众多,且各血清型间交互免疫力差,因此鉴定与筛选疫苗用优势菌株,将有利于流行地区的猪链球菌病的免疫预防。基于疫苗用菌株的血清型和免疫原性是最根本的原则,本实验室前期研究结果显示,SS2为安徽地区SS流行的优势血清型,在此基础上,通过致病性试验、抗原性试验和稳定性试验,综合筛选出2株疫苗菌株(代号为HF2、HF3)。本研究系在优化培养条件的基础上,通过疫苗菌株甲醛灭活条件及免疫佐剂的选择,以提高和保障制备的SS2灭活疫苗的良好抗原性,进一步比较相应商品化疫苗的免疫效果,从而为猪链球菌病的防控及多联疫苗的研究提供科学依据。将筛选出的2株疫苗菌株(HF2、HF3)进行以下试验:(1)将终浓度为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%的甲醛溶液各自加入生长至稳定期的HF2、HF3中,分别灭活5 h、9 h、10 h、11 h、12 h、13 h、14 h、15 h、20 h后,采用液体培养基、固体培养基和易感动物对HF2、HF3灭活的完全性进行检验。(2)HF2、HF3在终浓度为0.3%的甲醛灭活15h后,按不同体积比分别与五种佐剂(铝胶佐剂、弗氏佐剂、蜂胶佐剂、GEL 01聚合物佐剂、ISA201 VG矿物油佐剂)制备成SS2灭活疫苗,经物理性状检验、无菌检验和安全性检验合格后免疫小鼠,应用间接ELISA方法检测小鼠血清中IgG抗体水平和细胞因子含量(IL-4、IL-10、IFN-y、TNF-β、MCP-1);流式细胞术测定CD4+/CD3+、CD8+/CD3+T细胞亚群;攻毒试验测定免疫保护力;组织荷菌数试验测定SS2在小鼠体内定植情况;采集攻毒后小鼠肺脏、肝脏、脾脏、肾脏制作病理组织切片,观察病理变化。(3)将HF2、HF3分别培养至稳定期,加入终浓度为0.3%的甲醛灭活15 h后,与ISA201 VG矿物油佐剂乳化制备成灭活疫苗,与SS2商品化灭活疫苗(HA9801株)同步免疫小鼠,应用间接ELISA方法检测小鼠血清中IgG抗体水平和细胞因子含量(IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-β、MCP-1);流式细胞术测定CD4+/CD3+、CD8+/CD3+T细胞亚群;攻毒试验测定免疫保护力;组织荷菌数试验测定SS2定植情况;采集攻毒后小鼠肺脏、肝脏、脾脏、肾脏制作病理组织切片,观察病理变化。结果显示:(1)终浓度为0.3%及0.4%的甲醛,分别作用15 h及13 h,均可使HF2、HF3灭活完全。(2)ISA201 VG组诱导小鼠产生的抗体效价最高,明显高于其他佐剂组;ISA 201 VG组诱导小鼠产生的细胞因子水平均高于其他佐剂组;ISA 201 VG组产生的CD4+/CD3+、CD8+/CD3+T细胞比率高于其他佐剂组,且多数具有差异显著(P<0.05)。攻毒后,与其他四种佐剂组相比,ISA201 VG组攻毒保护率均为100%,且肺脏、肝脏、脾脏、肾脏细菌定植量均较低,结合病理组织变化,ISA 201 VG组表现出无病变或轻微病变。(3)SS2灭活疫苗(HF2株、HF3株)和SS2商品化灭活疫苗(HA9801株)二次免疫小鼠后的血清IgG抗体效价分别为1:25600、1:12800、1:25600;SS2灭活疫苗(HF2株)诱导小鼠产生细胞因子含量高于SS2灭活疫苗(HF3株)、SS2商品化灭活疫苗(HA9801株);SS2商品化灭活疫苗(HA9801株)CD4+/CD3+、CD8+/CD3+T细胞比率最高,但CD8+/CD3+T细胞比率与SS2灭活疫苗(HF2、HF3株)差异不显著(P>0.05);攻毒后,SS2灭活疫苗(HF2、HF3株)和SS2商品化灭活疫苗(HA9801株)免疫保护率均为100%;SS2灭活疫苗(HF3株)的病理组织变化较SS2灭活疫苗(HF2株)和SS2商品化灭活疫苗更明显。结果表明:受试疫苗菌株(HF2)在改良BHI培养基生长至稳定期后,经终浓度为0.3%的甲醛37℃振荡灭活(150 r/min)15 h,与ISA201 VG矿物油佐剂制备成灭活疫苗的免疫效果最好,免疫小鼠后不仅可产生较高水平的体液免疫和细胞免疫,还可完全抵抗强毒株的攻击。