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非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是由于肝细胞内脂肪代谢平衡的破坏,造成甘油三酯(Triacylglycerol,TG)蓄积所致。在体内甘油三酯与二酰甘油(Diacylglycerol,DAG)可相互转化,而二酰甘油激酶(Diacylglycerol Kinases,DGKs)能使二酰甘油发生磷酸化,从而转化生成磷脂酸(Phosphatidic Acid,PA)。因此,DGKs在二酸甘油蓄积过程中有着极其重要的作用。DGKs共分为五种类型,DGKθ是第V型中的唯一亚型。DGKθ可通过调控DAG和PA的浓度参与细胞内多种信号通路。有研究报道DGKθ参与葡萄糖异生、脂质代谢等过程,但其具体的分子机制与生理功能尚不清楚。本课题采用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,建立DGKθ基因敲除的HepG2细胞系,并进行DGKθ体外相关功能的研究。此外,在此基础上,采用腺病毒载体携带CRISPR/Cas9系统用于小鼠体内DGKθ功能研究。本课题通过体内外DGKθ功能研究,探索DGKθ在脂质代谢中的作用及其分子机制。本课题的研究内容主要包括以下几个方面:1.基于CRISPR/Cas9的DGKθ基因敲除HepG2细胞系的建立:设计并筛选出最佳sgRNA4,PCR扩增DGKθ打靶区域上下游同源臂序列,构建donor载体。将该质粒载体与Cas9表达载体共转染HepG2细胞,经抗性药物筛选后收集基因组,PCR及Sanger测序等方法鉴定获得DGKθ基因敲除细胞系。2.DGKθ基因敲除HepG2细胞系的体外功能研究:MTT法测定WT HepG2与DGKθ KO HepG2在0-72 h细胞增殖速率;各组细胞以油红O染液染色,分析细胞内脂质蓄积,同时测定细胞内PA与DAG含量。RT-PCR及Western blot检测各组细胞内糖脂代谢相关因子和胰岛素抵抗相关因子的表达变化。3.DGKθ在小鼠体内脂代谢中分子机制的探究:设计鼠源DGKθ sgRNA,并用T7E1酶切筛选出最佳sgRNA4。表达sgRNA的腺病毒载体pAd5/U6-sgRNA4包装成功后,与表达Cas9的腺病毒pAd5/tet-on-Cas9共同感染Hepal-6细胞,T7E1酶切验证体外打靶效率。在体外验证病毒载体具有打靶活性的基础上,将这两株病毒同时尾静脉注射小鼠,通过RT-PCR检测,获得肝脏特异性DGKθ基因敲低的小鼠模型;在此基础上,取各组小鼠血清,进行脂蛋白含量分析。运用HE染色及油红O染色,观察肝细胞内脂质蓄积情况;RT-PCR检测各组小鼠组织中DGKθ和脂质相关因子的mRNA表达情况。通过上述研究本课题取得了以下结果:1.成功筛选出活性最高的sgRNA4,并获得了 DGKθ基因敲除的HepG2细胞系。同对照组相比,DGKθKOHepG2细胞的增殖速率显著增加,且发现细胞内有明显的脂质蓄积;DGKθ KO HepG2细胞内的PA含量显著降低,而DAG含量显著上升。2.同对照组相比,DGKθ KO HepG2细胞内脂质合成相关因子FAS、PPARy和SREBP-1c的mRNA与蛋白水平表达量均上调,脂质代谢相关的因子CPT1a则下调;PKCε的磷酸化水平上升,而IRS-1的磷酸化水平则下降;mTOR和AKT磷酸化水平均降低。3.筛选出打靶活性最高的鼠源DGKθ sgRNA4,并获得了肝脏特异性DGKθ基因敲低的小鼠模型。4.同对照组相比,肝脏特异性DGKθ基因敲低的小鼠血清脂蛋白中总胆固醇(CHOL)与TG的含量显著性升高;肝组织切片HE染色显示肝细胞内存在明显的空泡结构,油红O染色发现细胞内橘红色脂滴增多。5.同对照组相比,肝脏特异性DGKθ基因敲低的小鼠脂质合成相关因子SREBP-1c,FAS和PPARy的mRNA表达显著上调,而脂质代谢相关蛋白CPT1a和HADHα的mRNA表达量无显著性差异。