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开心散始载于唐代孙思邈之《备急千金要方》,是治疗中医情志病的经典方,由人参、远志、茯苓、石菖蒲4味药组成。其方主治心气不定,五脏不足,忧愁悲伤不乐,忽忽喜忘,朝愈暮剧,或暮愈朝发等情志异常,类似于西医的抑郁,焦虑,学习记忆障碍等。本课题组前期的研究发现,开心散中远志寡糖酯类是中药复方抗抑郁的主要活性部位,其活性单体Tenuifoliside A (TFSA)可通过增加新生细胞合成DNA而减轻皮质酮对SH-SY5Y神经细胞的损伤,可明显增加慢性应激所致抑郁模型动物海马中磷酸化环磷腺苷反应元件结合蛋白(phospho-cAMP response element binding protein, p-CREB)和脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)的表达量,并能调节慢性应激大鼠HPA轴的功能,有明显的抗抑郁样作用。目前,抑郁神经营养假说认为BDNF分泌减少或与BDNF相关的信号转导通路受损是抑郁症发生的关键环节之一。BDNF结合高亲和力受体酪氨酸激酶B (tyrosine kinase B, TrkB)后可激活细胞内多条信号通路,其中ERK和PI3K信号通路是研究抗抑郁药物作用机制的重要靶标。本研究包括两部分内容：首先,在经典的抑郁动物模型(慢性温和应激模型)上检测抑郁动物BDNF/TrkB信号系统关键节点蛋白(TrkB, ERK, CREB, PI3K, Akt, GSK3β, BDNF)的变化,以及采用经典古方开心散治疗抑郁后,对BDNF/TrkB信号通路关键节点蛋白的影响,探索开心散抗抑郁作用的分子机制。其次,以开心散中的活性成分寡糖酯类单体化合物TFSA为研究对象,建立皮质酮(Corticosterone, CORT)损伤体外神经胶质瘤细胞模型以及原代培养海马神经元模型,评价TFSA的神经保护作用,并根据抑郁症发病机制的新理论,采用化学拮抗剂阻断方法从BDNF/TrkB信号转导通路阐明TFSA抗抑郁的细胞分子机制。在孤养结合慢性温和应激(CMS)大鼠抑郁模型上,作者观察抑郁动物脑中TrkB/BDNF/ERK和TrkB/BDNF/PI3K信号通路中关键蛋白(TrkB, p-ERK, p-CREB, PI3K, Akt, p-GSK30, BDNF)表达的变化,以及采用经典古方开心散治疗后,对抑郁动物脑中关键蛋白的影响,以期揭示开心散抗抑郁作用的分子机制。研究结果表明,慢性应激5周后,抑郁大鼠海马和前额皮层中TrkB受体水平及BDNF表达量均明显降低,PI3K, Akt, p-ERK蛋白水平亦同时降低,给予370mg·kg-1的开心散治疗2周后,即能改善由慢性应激所致的低TrkB受体水平；并能明显促进CMS大鼠海马中p-CREB, p-ERK, PI3K, Akt及BDNF蛋白的表达,但未能增加P-GSK3β蛋白的水平；同时开心散还可促进CMS大鼠前额皮层中p-ERK, p-CREB及BDNF蛋白的表达。本部分研究证明TrkB/BDNF信号通路在抑郁症的病理生理和抗抑郁作用机制上起重要作用,显示BDNF表达与抑郁症呈负关联关系,进一步验证了抑郁的神经营养假说。同时提示我们,开心散对抑郁模型大鼠抗抑郁治疗的分子机制是通过激活TrkB/BDNF信号系统中ERK和PI3K通路,促进关键蛋白TrkB, ERK, CREB, PI3K和Akt的磷酸化来上调BDNF的表达。在体外研究中,作者采用CORT模拟体内高CORT环境诱导损伤大鼠神经胶质瘤细胞(C6细胞),观察TFSA(30、10和3μmol·L-1)和地昔帕明(Desipramine, DIM,5μmol·L-1)对受损C6细胞的神经保护作用；检测TFSA对CORT诱导C6细胞损伤的存活率影响、Hoechst33258染核后细胞凋亡形态变化、细胞内ERK及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达以及Caspase-3激酶活力的变化。结果显示,与对照组比,0.8mmol·L-1的CORT对C6细胞有明显的损伤作用,其细胞存活率降低至69.58%；细胞核形态改变,出现凋亡小体；胞内ERK蛋白和抗凋亡蛋白Bcl-2表达量明显降低(P<0.01),而促凋亡蛋白Bax的表达和Caspase-3激酶活力增加(P<0.01)。与模型组相比,TFSA各剂量组均有不同程度对抗CORT损伤的作用,细胞存活率提高至84.48%,细胞核形态有明显改善,和DIM组相比没有统计学意义；同时细胞内的ERK和Bcl-2蛋白表达量明显增加P<0.01); Bax蛋白和Caspase-3激酶活力降低(P<0.05)。表明TFSA对CORT诱导损伤的C6细胞具有保护作用,其机制可能与TFSA激活C6细胞内ERK通路,提高抗凋亡蛋白Bcl-2表达,降低促凋亡蛋白Bax和Caspase-3激酶活性有关。为进一步研究TFSA的神经保护作用机制,作者研究了TFSA对C6细胞BDNF表达的影响,并设置一系列时间点(0,2,5,7,10,15,30,45,60min)考察TFSA诱导TrkB/BDNF/ERK和TrkB/BDNF/PI3K信号通路中关键蛋白磷酸化过程；同时采用TrkB受体拮抗剂(K252a),ERK拮抗剂(U0126)和PI3K拮抗剂(LY294002)预先拮抗C6细胞再以TFSA干预,检测拮抗前后以上信号通路中关键蛋白的表达水平。结果显示,与对照组相比,TFSA (6,10和30μmol·L-1)剂量组能明显促进C6细胞增殖(P<0.01)且无明显细胞毒性,并能诱导C6细胞内BDNF的表达呈剂量依赖性；同时,10μmol·L-1的TFSA可在不同的时间点上诱导蛋白磷酸化,其中ERK, CREB和GSK3β的磷酸化水平变化明显；在用拮抗剂预处理后,TFSA诱导关键蛋白(TrkB, ERK, CREB, PI3K, Akt和GSK3β)的磷酸化作用被不同程度拮抗,并且拮抗后BDNF的表达水平也明显降低(P<0.01)。综合以上研究结果,表明TFSA的神经保护机制与激活TrkB/BDNF信号系统介导的ERK和PI3K通路,促进ERK和Akt磷酸化后进而促进下游CREB和GSK3β的磷酸化,最终促进BDNF表达有关。作者在原代培养大鼠海马神经元模型上考察了TFSA的神经保护作用机制。体外培养新生12h内的SD大鼠海马神经元细胞7天后,以不同浓度TFSA(1,3,10和30μmol·L-1)及BDNF (25pg·L-1)处理海马神经元细胞,检测TFSA对神经元存活率和BDNF表达量的影响；并采用TrkB受体拮抗剂预处理海马神经元,再以TFSA干预,检测p-TrkB, TrkB, p-ERK, ERK和BDNF蛋白的表达水平。结果显示,与对照组相比,TFSA(1,3和10μmol·L-1)剂量组海马神经元存活率明显升高；TFSA对BDNF表达量呈现浓度和时间依赖性,在6h时BDNF表达量明显升高,且10μmol·L-1的TFSA能明显促进BDNF的释放(和对照组相比,P<0.01),同时海马神经元中p-TrkB和p-ERK的表达水平也明显升高；加入K252a预处理后,ERK和TrkB的磷酸化作用被阻断,BDNF的表达量也低于单用TFSA处理组(P<0.01)。上述研究结果提示,TFSA可以促进大鼠海马神经元存活,具有神经保护作用,其机制可能与激活TrkB/ERK/BDNF通路促进ERK磷酸化有关。综上,本研究论文从动物水平上验证了开心散的抗抑郁作用,发现开心散抗抑郁作用的分子机制是通过上调脑内BDNF及TrkB受体表达来激活TrkB-BDNF信号系统,在海马中同时介导ERK和PI3K信号通路,而在前额皮层则主要介导ERK信号通路对脑神经元发挥神经营养作用。作者进一步在C6细胞株和原代培养神经细胞水平上证明了开心散中活性成分TFSA的神经保护机制与激活TrkB/BDNF介导的ERK和PI3K信号通路,促进ERK和Akt磷酸化后进而促进下游CREB和GSK3β的磷酸化,最终促进BDNF表达有关。据此作者认为TFSA作为古方开心散发挥抗抑郁作用的主要活性成分,其对神经细胞的保护和营养是开心散抗抑郁的主要作用机制。