【摘 要】
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家蚕质型多角体病毒（Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus,Bm CPV）是呼肠孤科病毒家族中结构最简单的单衣壳ds RNA病毒,作为呼肠孤科病毒的代表种,对CPV病毒的研究具有重要的意义。利用冷冻电镜三维重构技术对CPV病毒的三维结构进行重构,获得了病毒的原子分辨结构,结果显示:CPV病毒为拥有12个顶点的对称正20面体,衣壳由60个非重复单元（as
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家蚕质型多角体病毒（Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus,Bm CPV）是呼肠孤科病毒家族中结构最简单的单衣壳ds RNA病毒,作为呼肠孤科病毒的代表种,对CPV病毒的研究具有重要的意义。利用冷冻电镜三维重构技术对CPV病毒的三维结构进行重构,获得了病毒的原子分辨结构,结果显示:CPV病毒为拥有12个顶点的对称正20面体,衣壳由60个非重复单元（asymmetric unit）组成,每个单元包括1个塔状突起蛋白（turret protein,TP）、2个大突起蛋白（large protrusion protein,LPP）和2个病毒衣壳蛋白（capsid shell protein,CSP）。病毒内部10条ds RNA分别与10个转录酶复合体（transcriptional enzyme complex,TEC）特异性结合并镶嵌在CPV的10个固定位置的顶点上。该病毒TP蛋白上具有若干个活性位点,可以通过结合不同的小分子,来调控病毒的结构蛋白发生变化,但这些变化对病毒转录和加帽过程的意义不详。本研究应用分子生物学技术和杆状病毒多基因表达系统,成功表达了Bm CPV病毒m RNA加帽酶TP蛋白及其突变蛋白m TP（301位的色氨酸、302位的天冬氨酸和305位的酪氨酸）,通过吸光度测定蛋白反应后底物游离磷浓度的方法,确定了在近原子分辨率结构中推定的ATPase酶活性位点,并证明了301位的色氨酸、302位的天冬氨酸和305位的酪氨酸在TP蛋白ATPase酶活性位点中有着重要的作用。此外,通过冷冻电镜三维重构技术,获得了原位状态下不同buffer处理的CPV病毒近原子分辨率Rd Rp结构,并解析了SAM、GTP和ATP调控病毒Rd Rp发生形变结构及其在病毒m RNA转录过程的功能。通过解析小分子对CPV病毒的调控,揭示了一条存在于病毒内部的“信号通路”,同时揭示了病毒TEC的结构变化与转录之间的关系,为相关ds RNA病毒转录加帽机制研究、药物研发和病毒病防控等研究提供方法学的借鉴。
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