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猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种猪的急性、高度传染性肠道疾病,以感染猪呕吐、水样腹泻、脱水,以及仔猪的高死亡率为主要特征,各种年龄段猪均易感。PED于1984年在中国被首次确认,之后随着二联灭活苗或弱毒苗的使用使疫情基本保持稳定。2010年10月以来,由PEDV变异株导致的PED再次暴发,对我国的养猪业造成了巨大的损失。PEDV变异株与经典疫苗株的差别主要集中在纤突(S)蛋白的N端,基于经典毒株的灭活苗和弱毒苗不能为猪群提供足够的免疫力来对抗PEDV变异株的感染。抗PEDV免疫主要以黏膜免疫为主,目前PEDV变异株的高效培养还存在一定的难度,因此,探索各种途径研制出能够诱导黏膜免疫的针对PEDV中国变异株的新型高效疫苗势在必行。腺病毒载体具有感染细胞范围广,能有效刺激机体产生体液免疫、细胞免疫以及黏膜免疫应答等优势,已被广泛应用于人和动物的基因治疗和疫苗研发。复制型人腺病毒血清4型(human adenovirus serotype 4,HAd V-4)疫苗株已经在防控人类急性呼吸道疾病领域应用多年,并被证明是安全有效的,它能够模拟天然病毒感染宿主细胞,刺激机体产生包括黏膜免疫的各级免疫反应。本研究中首次尝试以复制型HAd V-4疫苗株为载体,构建了重组基于HAd V-4疫苗株的病毒载体系统,并将PEDV中国变异株S蛋白(N端1~380aa)基因插入HAd V-4基因组中,构建出能够表达PEDV中国变异株S蛋白的重组腺病毒,并对重组病毒的免疫原性进行了初步研究,以期为研制抗PEDV高效疫苗提供思路和为更有效防控猪流行性腹泻提供备选新工具。本论文研究内容分为以下三个部分:1.复制型人腺病毒血清4型载体系统的构建及重组病毒在猪源细胞系上生长特性研究本试验构建了基于HAd V-4疫苗株的复制型重组HAd V-4载体系统,该系统包含病毒基因组骨架载体p Ad4FAST以及穿梭载体p Ad4FAST-shuttle,两载体在BJ5183宿主菌中同源重组后得到重组腺病毒感染性克隆,提取全长感染性克隆DNA,经Pac I酶切后转染293细胞,拯救出重组病毒。为验证该系统的可行性,以EGFP作为标记基因成功构建能够表达绿色荧光蛋白的重组腺病毒r Ad4△E3-EGFP。将重组病毒r Ad4△E3-EGFP感染不同的猪源细胞系,均能观察到明显的细胞病变和绿色荧光。研究结果为利用HAd V-4疫苗株作为载体研发猪用疫苗提供了工具和理论依据。2.表达PEDV中国变异株S蛋白的复制型重组HAd V-4的构建及鉴定本试验选取PEDV变异株与经典疫苗株纤突(S)蛋白的差异区域(N端1~380aa)基因为靶基因,利用试验一中构建的HAd V-4载体系统,将该基因插入到HAd V-4基因组E3区构建重组HAd V-4感染性克隆,将感染性克隆转染293细胞后拯救出重组病毒r Ad4△E3-S。Western blot结果显示,重组病毒成功表达PEDV S蛋白,为进一步评价重组病毒的免疫原性提供了试验材料,也为PEDV活载体疫苗的研发奠定基础。3.表达PEDV中国变异株S蛋白的复制型重组病毒r Ad4△E3-S在小鼠体内免疫原性研究为研究所构建的表达PEDV中国变异株S蛋白的重组病毒的免疫原性,本研究选取小鼠作为动物模型,重组病毒首次免疫小鼠后,即能刺激小鼠产生抗PEDV S蛋白的抗体,再次免疫后,抗体水平显著上升并能维持较长时间。病毒中和试验结果显示,重组病毒r Ad4△E3-S免疫小鼠产生的抗S蛋白抗体对变异毒株CH/ZMDZY/11和疫苗株CV777均有中和作用,但对变异株的中和活性明显高于对经典疫苗株的中和活性。抗S蛋白抗体抑制变异毒株CH/ZMDZY/11感染Vero细胞的平均中和滴度为1:68,而抑制疫苗株CV777感染Vero细胞的平均抗体滴度只有1:8。利用体外淋巴细胞转化试验和流式细胞技术检测了免疫小鼠T淋巴细胞反应。结果显示,体外经S蛋白抗原刺激以后,重组病毒免疫组小鼠淋巴细胞的增殖活性显著高于空载体病毒免疫组和DMEM对照组。并且,重组病毒免疫组较其它试验组小鼠CD4+和CD8+T淋巴细胞分泌PEDV S蛋白特异性IFN-γ、IL-2和TNF-α的水平增高,提示重组病毒能刺激小鼠产生抗原特异性细胞免疫应答。试验结果为进一步研究重组病毒在猪体上的免疫原性奠定基础,也为PEDV活载体疫苗的研发提供理论依据。