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本研究的第一个目的是验证一种具有实际意义，简化易行构建改形抗体的新方法。与以往其它方法不同的是：该方法采用实验定向分子进化方法，不需要对抗体序列进行空间模拟，以确定人源抗体受体的FRs以及受体FRs上的哪个氨基酸残基需要进一步突变；该改形方法将抗体的改形及亲和力成熟于同一步骤完成，从而节省构建的时间及劳动强度。利用该方法构建了改形抗CD28重链单域抗体。根据鼠源抗CD28VH氨基酸序列，从GenBank中得到两个与该序列最同源的人源抗体，选用其中之一作为改形抗体的主框架FRs区。在保留鼠源CDRs氨基酸残基的同时，对主框架FRs一些氨基酸残基进行可选择替换突变，可选择替换原则根据对原始鼠源序列；鼠源抗体所在Kabat分类中的种属序列；两个人源抗体序列及人源抗体所在Kabat分类中的种属序列的比较而确定。选择大肠杆菌喜好密码子，推导出其基因序列；合成大小不同的核苷酸片段，采用重叠PCR扩增得到改形抗体全长基因。在合成片段时，将突变位点要被替换氨基酸残基和替换氨基酸残基的核苷酸采用简并合成，使二者都有机会在完整基因中出现。为了进一步提高改形抗体基因数目，在重叠PCR扩增改形抗体全长基因时，采用高浓度Mg2+和Taq DNA聚合酶，以便进一步随机引入突变。利用PCR产物构建了一个改形抗CD28VH抗体库，经过三轮淘选，获得了具有高结合活性的改形抗体基因。进一步将两个改形基因与c-myc及人IgG3’CL铰链区基因融合在大肠杆菌BL21（DE3）中表达，复性后的融合表达蛋白仍表现为具有较高与CD28分子的结合活性。这一结果表明，该构建改形抗体方法是有效和可行的，通过一步就可以获得满意的改形抗体。 本研究第二个目的是构建及表达一种新的三特异抗体：抗人卵巢癌scFv×改形抗CD3 scFv×改形抗CD28VH。构建的三特异抗体有两种类型：环形三特异抗体；非环形三特异抗体。在三特异抗体构建中使用了不同的连接肽序列（interlinker），这些序列的使用，引入了一些不同的生物学功能。两种类型的三博土论文 中文摘要特异抗体的基因在大肠杆菌BLZI pE3)中表达后，测定了表达蛋白与CD28分子的结合活性。