肝癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一。肝癌细胞的侵袭和转移是肝癌治疗失败和患者致死的主要原因,因此阐明肝癌侵袭转移的机制对于肝癌的治疗十分重要。有关肿瘤转移的机制目前存在肿瘤干细胞学说、上皮-间质转变学说、器官特异性转移学说等,尽管在肝癌转移中均有较深入的研究,但都不能圆满解释肝癌转移的机制,近年来细胞融合学说逐渐成为肿瘤转移研究的热点。细胞融合在身体生长发育各个阶段,如受精卵形成、器官发生、骨和骨骼肌形成等过程中发挥不可或缺的作用。许多研究表明,细胞融合在肿瘤转移中起重要作用,但由于缺乏可应用的遗传标记物,在人体肿瘤发生、转移过程中,很难监测到细胞融合,所以罕见与肿瘤转移相关的细胞融合现象报道。尽管如此,Chakraborty和Pawelek, J.两位学者分别于2004年和2005年发表了两例肾细胞癌患者接受造血干细胞移植后,在远处转移淋巴结内发现供者造血干细胞和受体肿瘤细胞融合的临床报道,说明细胞融合现象在人体内是客观存在的。同时,He Xh和Tsang TC等于2005年提出肿瘤转移的细胞融合理论,即恶变前细胞(包括良性肿瘤细胞)与骨髓源性干细胞(bone marrow-derived stem cells, BMDSCs)融合后引起前者恶性转化,产生高度恶性、转移性肿瘤细胞。骨髓源性干细胞(BMDSCs)主要包括造血干细胞(HSCs)、骨髓间充质干细胞(MSCs)和多能成体祖细胞(MAPCs)。MSCs具有强大的多向分化、自我更新、组织浸润和迁移能力,主要参与组织损伤修复、神经组织再生和肿瘤微环境形成等,在与肿瘤细胞融合方面未见报道。本研究在体外应用PEG方法促进MSCs与肝癌细胞HepG2融合,应用流式细胞术、染色体分析等方法筛选出融合细胞,体内、外实验观察细胞融合对肝癌细胞侵袭、转移能力的影响,并进一步探讨其可能的分子机制,为阐明肝癌转移的机制提供一条创新性思路。研究方法1.大鼠MSCs的培养、鉴定及标记采用全骨髓直接贴壁法获得原代大鼠MSCs,差速贴壁结合消化控制法纯化细胞,镜下观察细胞形态,流式细胞术检测第3-6代MSCs的细胞表面标志CD34、CD45、CD90、CD105的表达。分别取第1、4、8代MSCs测定细胞增殖能力,绘制生长曲线。2ug/ml Dil与MSCs孵育1h,荧光显微镜观察红色荧光。2. MSCs与低转移肝癌细胞的融合及融合细胞的筛选、鉴定通过肿瘤细胞侵袭、划痕实验筛选低转移肝癌细胞系HepG2;构建稳定转染GFP基因的低转移肝癌细胞HepG2,采用PEG方法促进分别标记红色和绿色荧光的MSCs与HepG2融合,流式细胞术分选同时标记红色和绿色荧光的融合细胞,染色体分析和DNA含量测定进一步鉴定融合细胞。3. MSCs与肝癌细胞HepG2融合对肝癌细胞侵袭、转移的影响细胞侵袭、迁移实验检测细胞融合对肿瘤细胞的侵袭、迁移能力的影响；CCK-8法检测细胞融合对细胞增殖能力的影响；软琼脂克隆形成实验检测单个肿瘤细胞空间克隆形成能力；流式细胞术检测细胞周期变化。收集HepG2、MSCs和融合细胞,分别与Matrigel混匀,注射至BALB/c裸鼠肝脏,建立肝脏原位肿瘤模型,观察融合前后肿瘤细胞转移能力的变化。4. MSCs与肝癌细胞HepG2融合促进肝癌转移的分子机制采用Western blot方法检测上皮-问质转变(EMT)标志性蛋白E-cadherin和Vimentin的表达,检测EMT主要调节因子Twistl和Snail的表达;RT-PCR检测上述基因的mRNA水平的改变；明胶酶谱法检测MMP2和MMP9表达水平的改变。研究结果1.经骨髓分离培养所得到的细胞,通过流式细胞仪检测细胞表面标志物CD34-, CD45-,CD90+, CD105+,符合MSCs特征。生长曲线表明MSCs第1、4代增殖能力较强,第8代MSCs增殖能力减弱。将第3-5代MSCs与DiI孵育后,荧光显微镜观察MSCs为红色荧光,流式细胞术检测红色荧光标记率为99%。2.将pEGFP-N1质粒稳定转染至肝癌细胞HepG2,经过500μg/ml G418筛选,获得了稳定表达GFP的肝癌细胞株HepG2-GFP;将分别标记红色和绿色荧光的MSCs和HepG2两种细胞融合后,流式细胞术分选同时标有红色和绿色荧光的融合细胞,融合率为6.9%；染色体分析结果显示融合细胞平均染色体条数为128.9±21.3, HepG2-GFP细胞为89.6±16.0,而MSCs为41.3±4.1；DNA含量测定表明融合细胞中有多倍体形成。3.侵袭和迁移实验结果表明,融合细胞的侵袭、迁移能力明显比HepG2细胞增强,CCK-8实验结果提示融合细胞的增殖能力稍弱于HepG2;软琼脂克隆形成实验发现融合细胞空间形成克隆能力弱于HepG2,而MSCs无空间克隆形成能力。制备肝脏原位肿瘤模型,结果发现,融合细胞组肝内转移灶平均数目为4.50±1.29, HepG2组肝内转移灶平均数目为2.0±0.82,两组比较有统计学差异(P<0.05)。融合细胞组肝癌肺转移发生率为57.14%,而HepG2组为28.58%,两组肺转移灶数目相比有统计学差异。MSCs组肝脏、肺脏未见肿瘤形成。结果提示,融合细胞在体内转移能力增强。4. Western blot检测EMT标志性蛋白E-cadherin和Vimentin的表达,结果表明融合细胞E-cadherin表达降低,而Vimentin表达明显升高,说明MSCs与HepG2融合后融合细胞发生了EMT转变；进一步检测EMT调节因子Twist1和Snail表达,发现融合细胞中Twist1和Snail表达均增强；RT-PCR检测上述指标的mRNA表达水平与Western blot检测结果一致；明胶酶谱实验结果证实,在融合细胞中MMP2和MMP9表达水平均比HepG2高。研究结论1. MSCs与低转移肝癌细胞HepG2融合,可提高肝癌细胞的侵袭、迁移能力；体内实验表明MSCs与低转移肝癌细胞HepG2融合能够促进肝癌转移。2. MSCs与低转移肝癌细胞HepG2融合后融合细胞发生EMT转变,并且MMP2和MMP9表达增强,可能是MSCs与HepG2融合后融合细胞转移能力增强的机制。