目的：自噬是近十年来生命科学研究的热点，是指机体在饥饿或其他应激状态下，细胞通过自我消化一些非必需的大分子物质(主要是细胞内的长寿蛋白质)和受损的细胞器(如线粒体)，为细胞的生长提供新的物质基础和能量，因此维持细胞内环境的稳态是其重要的生理功能之一。自噬相关基因(Atg)是在研究自噬的过程中被发现的，目前认为各个Atg基因在自噬的发生发展过程中发挥着不同的作用，部分参与隔离膜的形成，部分参与自噬体的形成，部分参与自噬溶酶体的形成。各个Atg基因相互配合，共同完成自噬的全过程。正因为如此，目前对Atg基因的认识更多地停留在自噬的领域，对于其在细胞生命过程中的其他作用所知甚少，也鲜见相关研究报道。细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种，它是一种相对缓慢、消耗能量、基因导向的过程，它涉及细胞内一系列生化改变，如特定基因的表达、功能蛋白的合成、相关酶体的激活、细胞内相关信号分子的转运等，细胞凋亡与机体内的肿瘤发生、免疫状态、神经性疾病、肝炎、心血管疾病以及败血症等多种疾病及病理状态关系密切，因此，对细胞凋亡的发生及其缺失等机制研究，在临床上具有重要的实际意义。活性氧族(ROS)是一组高反应活性的分子，包括单态氧、氢氧自由基、超氧阴离子、一氧化氮和过氧化氢。研究表明，ROS在细胞凋亡过程中，发挥着关键性的作用。由细胞内线粒体或其他途径产生的ROS，可以氧化一系列细胞内成分，包括脂类、蛋白质和DNA，进而损伤细胞的结构和功能。对于细胞自噬与细胞凋亡两种重要的生命活动间相互作用的机制不明，是目前自噬研究的一个瓶颈；而Atg基因在这其中发挥了何种作用，也是一个亟待解决的问题，只有进一步明确各关键Atg基因在其他生命活动过程中所扮演的角色，才有可能更好的分析自噬与其他生命活动的联系，更好地把握自噬，利用自噬。鉴于自噬和细胞凋亡在生命过程中的重要作用，而对于两者之间相互作用的研究不甚明确，为了探索自噬和细胞凋亡之间的相互调节，本实验拟选用Atg5-/。小鼠胚胎成纤维细胞(Atg5-/- MEFs细胞)作为特异性自噬缺失细胞，和野生型小鼠胚胎成纤维细胞(WT MEFs细胞)一起作为研究对象，观察两种MEFs细胞对由硝普钠(sodium nitroprusside，SNP)和过氧化氢(hydrogen dioxide，H2O2)两种ROS引起的细胞凋亡的反应情况，并通过雷帕霉素(rapamycin，Rapa)或氯喹(chloroquine，CDP)的预处理和抑制相关自噬基因的表达来调节WT MEFs的自噬水平，探究自噬和细胞凋亡之间的关系及其潜在机制。[　　 方法：⑴细胞培养和药物处理：WT和Atg5-/- MEFs细胞培养在含10％小牛血清和1％青霉素-链霉素的DMEM培养液中，置于含5％CO2，37℃恒温培养箱中培养。药物处理时，分别给予SNP(1.0 mM)和H2O2(0.25mM)，各作用3，6，9，12h。⑵流式细胞术PI活细胞染色：药物处理后，用流式细胞术PI活细胞染色测定WT和Atg5-/- MEFs细胞的活性；Hoechst33258染色：在荧光显微镜下，用Hoechst33258染色测定药物处理12h后，观察细胞的着色情况。⑶Western blotting实验：用westem blotting实验检测药物处理不同时间点凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP等的表达情况。⑷自噬的检测：WTMEFs细胞用Rapa(10 nM)或CDP(20μM)预处理1h，诱导或抑制细胞内的自噬水平，再给予SNP(1.0 mM)处理12h；用western blotting实验检测LC-3 II和p-S6K蛋白的表达情况。⑸SiRNA:用SiRNA技术抑制WT MEFs细胞中Atg5和Atg7的表达，作用24h后，给予SNP(1.0 mM)处理12h。⑹瞬时转染：在Atg5-/- MEFs细胞中，进行GFP(0.06 ng)质粒或GFP-Atg5(0.2 ng)质粒的瞬时转染，共转染18h。　　 结果：①Atg5-/- MEFs细胞能够明显耐受SNP和H2O2诱导的细胞凋亡。经1.0mM的SNP或0.25mM的H2O2处理后，Hoechst33258染色荧光显微镜下观察，WTMEFs细胞表现出明显的细胞凋亡特征，可观察到明亮的蓝色亮点，即皱缩或断裂的染色质；而Atg5-/- MEFs细胞则相对正常，整个细胞相对均染，没有蓝色亮点的凋亡小体出现；流式细胞术结果进一步证实了Atg5-/- MEFs细胞对SNP和H2O2诱导的细胞凋亡的耐受，经SNP处理9h后，超过60％的Atg-/- MEFs细胞依然存活，而超过85％的WT MEFs细胞已发生死亡，经H2O2处理12h后，Atg5-/-MEFs细胞的存活率高达80％以上，而仅有少于10％的WT MEFs细胞存活；对相关凋亡蛋白的western blotting实验检测，也进一步说明了Atg5-/- MEFs细胞对凋亡的耐受，其Caspase-3，-8，-9和PARP的切割活化形式的表达均少于和/或迟于WT MEFs细胞的发生。②Atg5-/- MEFs细胞对凋亡的耐受，并不是通过自噬相关途径介导的。首先，流式细胞术PI染色和western blotting实验检测结果显示，经10nM的Rapa或20μM的CDP预处理1h后，对SNP诱导的WT MEFs细胞的凋亡没有促进或抑制作用，流式细胞术检测结果显示，Rapa或CDP的预处理不影响细胞的存活率，westernblotting实验的结果显示，Rapa或CDP的预处理同样不影响凋亡相关蛋白的表达；其次，抑制WT MEFs细胞中的自噬相关基因Atg5和Atg7对SNP诱导的细胞凋亡的作用并不相同，流式细胞术和westem blotting实验的检测结果显示，抑制Atg5的表达，对SNP诱导的WT MEFs细胞凋亡具有一定的保护作用，而抑制Atg7的表达则完全没有作用。③Atg5-/- MEFs细胞对凋亡的耐受是由于其缺乏了Atg5基因。对Atg5-/-MEFs细胞进行GFP-Atg5质粒的瞬时转染之后，不需给予任何其他刺激，Atg5过表达本身就能引起Atg5-/- MEFs细胞发生凋亡。④Atg5可能通过JNK-p53信号通路发挥其促进凋亡的作用。给予SNP处理3h后，WT MEFs细胞p-JNK的表达即有明显增加，而在Atg5-/- MEFs细胞中，则明显滞后；同时，p53在Ser15和Ser20位点上的磷酸化水平显著提高，并且WT MEFs细胞在Ser20位点上的磷酸化明显比Atg5-/- MEFs细胞更快更强；而当抑制WT MEFs细胞中的JNK表达时，p-JNK、p-P53和PARP的切割形式的表达都相应地明显下降。　　 结论：⑴与WT MEFs细胞相比，Atg5-/- MEFs细胞能明显耐受SNP(1.0mM)和H2O2(0.25mM)诱导的细胞凋亡；⑵这种耐受并不是由于其自噬缺陷，而是Atg5本身的作用，并且Atg5的这种作用很有可能是通过JNK-p53这条信号通路介导的。