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端粒是由许多简单重复序列及相关蛋白组成的染色体末端复合结构,端粒酶是具有逆转录酶特性的核糖核蛋白复合物,能以自身的RNA为模板合成端粒重复序列,加至新合成的DNA链末端,维持端粒平衡从而保证染色体末端结构完整性及解决末端复制问题。端粒与肿瘤、衰老等生理或病理状态都有密切关系,端粒酶蛋白结构及其调控机制是当今研究的重要方向。人端粒酶至少由三个亚单位组成,即端粒酶RNA(hTR)、端粒酶相关蛋白质1(TP1)和端粒酶蛋白催化亚单位(hTERT/hTRT/hEST2),其中hTERT被认为是端粒酶的主要逆转录酶部分。为了发现新的端粒酶蛋白亚单位或调控hTERT的端粒相关分子,通过构建pGBKT7-hTRT诱饵融合蛋白表达载体,应用酵母双杂交系统技术,从人睾丸cDNA文库中筛选出六种与hTERT作用的端粒相关未知蛋白,它们的编码基因为LOXL3、HKR3、T-STAR、SMARCB1、par-4和NISCH。本研究通过构建LOXL3和HKR3的正、反义真核表达载体,转染不同的肿瘤细胞株,观察LOXL3和HKR3对端粒酶活性的影响,进一步了解LOXL3和HKR3与端粒酶的关系。方法:1、从ATCC购买LOXL3和HKR3的cDNA克隆;2、构建正、反义LOXL3和HKR3真核表达载体;3、培养肿瘤细胞株SGC-7901、HepG2和SHG44,并确定它们的最小杀死浓度;4、应用脂质体转染法将正、反义LOXL3和HKR3真核表达载体转染以上三种肿瘤细胞,并在最低抑制浓度的G418选择压力下筛选稳定转染细胞株;5、用RT-PCR法检测转染细胞的neo基因表达,证实细胞转染的正确性;6、运用RT-PCR半定量法测定肿瘤细胞未转染组和正、反义转染组的LOXL3和HKR3表达量;7、运用TRAP-ELISA法测定肿瘤细胞未转染组和正、反义转染组的的端粒酶活性;8、使用SPSS10.0统计软件进行分析处理结果。结果:1、酶切鉴定证实LOXL3正义表达载体pcDNA3.1(+)-LOXL3-S、LOXL3反义表达载体pcDNA3.1(-)-LOXL3-AS、HKR3反义表达载体pCL-neo-HKR3–AS构建成功;2、SGC-7901 、HepG2和SHG44细胞的MIC浓度分别为400、700、200ug/ml;3、转染后的肿瘤细胞RT-PCR法显示均有neo基因表达,说明转染成功;4、三株细胞均有LOXL3和HKR3表达,与未转染组相比,正、反义转染组的LOXL3和HKR3<WP=9>表达量均有显著性差异(P<0.05);5、与未转染组相比,SGC-7901、HepG2 、SHG44细胞在LOXL3正义基因转染后端粒酶活性分别降低5.4%、9.3%和升高7.5%,反义LOXL3基因转染三种细胞后端粒酶活性分别升高7.3%、8.5%和降低7.7%,与未转染组细胞均无显著性差异,从此结果看,LOXL3对端粒酶活性无明确影响;6、正义HKR3基因转染SGC-7901、HepG2 、SHG44细胞后端粒酶活性分别降低20.9%、27.4%和29.4%,反义HKR3基因转染SGC-7901、HepG2 、SHG44细胞后端粒酶活性分别升高11.9%、9.6%和15.8%,与未转染组均有显著性差异;7、对正、反义HKR3转染SGC-7901、HepG2 、SHG44前后的HKR3 mRNA和端粒酶活性之间进行相关性分析,显示有较强的负相关(r=-0.783,P=0.013),即HKR3表达升高时端粒酶活性降低,而HKR3表达抑制时端粒酶活性升高。但相关性分析仅仅说明HKR3会影响端粒酶活性。结论:1、成功构建了LOXL3正、反义真核表达载体pcDNA3.1(+)-LOXL3-S、pcDNA3.1(-)-LOXL3-AS、HKR3反义真核表达载体pCL-neo-HKR3 –AS;2、LOXL3和HKR3正、反义真核表达载体成功转染了肿瘤细胞株SGC-7901、HepG2 、SHG44;3、LOXL3未显示与端粒酶活性的相关性;4、HKR3与端粒酶活性呈负相关,但还需进一步研究;5、端粒酶活性与hTERT的表达有良好的一致性。