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研究背景基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)属于披膜病毒科甲病毒属的虫媒病毒,其感染可引起以发热、皮疹、关节痛等为主要特征的基孔肯雅热(Chikungunya fever,CHIKF),在少数感染者中可引起中枢神经系统感染,可能导致死亡或严重后遗症。近年来,随着全球气候环境因素的改变、人类活动及迁徙,CHIKV传播范围呈扩大趋势。尤其是东中南非型(Eastern/Central/Southern African,ECSA)基孔肯雅病毒在2004年暴发流行后,进化出印度洋分支(Indian Ocean Lineage,IOL),CHIKV获得了适应性突变(A226V),使其可在分布更广的白纹伊蚊中大量复制,从而导致了亚洲地区的普遍流行。近20年来,CHIKV从非洲大陆迅速扩散到亚洲、美洲、欧洲等地,造成数百万人感染,上千人死亡,已成全球性公共卫生问题。目前尚无获批的可用于人类的防治疫苗和抗病毒药物。研究目的(1)确认CHIKV不同亚型不同毒株之间在细胞侵入、复制和致病性等方面的差异,鉴定出造成CHIKV致病性差异的关键蛋白和氨基酸残基;(2)试图从细胞和动物模型两个层面探明病毒基因变异影响CHIKV细胞侵入、复制和致病的机制,为CHIKV疫苗和抗病毒药物的研制提供新的靶点。研究方法(1)根据Gen Bank公布的CHIKV不同毒株的c DNA序列,对ECSA型(Ross,Ross-low-psg)及ECSA型IOL分支(LR2006-OPY1)进行病毒全长基因组构建。通过相邻片段酶切、连接获得CHIKV基因组全序列,在其5’端引入T7启动子序列,在3’端引入Poly A结构和NotⅠ限制性内切酶酶切位点,整个序列插入p UC18载体,获得含有完整CHIKV基因组的质粒。通过体外转录、转染的方法,在293T细胞中表达病毒蛋白,用转染上清感染Vero细胞获得拯救CHIKV病毒。(2)采用反向遗传技术,在感染性克隆的结构基因和非结构基因,即ns P4及C基因之间插入增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,Egfp)报告基因,使用插入了报告基因的CHIKV感染Vero细胞,可以根据荧光强度和面积变化判断病毒在细胞中的复制效率,比较不同毒株之间的复制动力学差异。(3)在感染性克隆的结构基因和非结构基因之间插入Nano Luc~?荧光素酶报告基因,使用插入了报告基因的CHIKV感染小鼠,利用活体成像检测系统,实时监测小鼠体内在荧光素酶作用下产生的辉光型信号,根据发光信号的位置初步判断病毒侵袭小鼠的主要器官和组织。(4)将Ross株和LR2006-OPY1株的结构基因相互置换,观察置换后的重组病毒及其亲本病毒噬斑大小的变化;将Ross株的ns P1-4和E1-3基因分别替换为Ross-low-psg株的相应基因,比较置换后的重组病毒与亲本病毒对小鼠的毒力变化。鉴定出造成CHIKV致病性差异的关键蛋白。研究结果(1)建立了CHIKV反向遗传技术,获得了CHIKV感染性克隆,并拯救Ross株、Ross-low-psg株(以下简称Ross-low)、LR2006-OPY1株(以下简称LR2006)病毒及表达Egfp报告基因(Ross-Egfp、LR-Egfp)、Nano Luc~?荧光素酶报告基因(Ross-Nano Luc、LR-Nano Luc)的病毒。获得了LR2006结构基因置换的Ross株(Ross-LR)、Ross结构基因置换的LR2006株(LR-Ross)、以及Ross-Low株单基因置换的Ross株(Ross-E1、Ross-E2、Ross-E3、Ross-NS2、Ross-NS3和Ross-NS4)。(2)含Egfp报告基因的病毒与亲本病毒相比,致细胞病变效应、病毒噬斑大小、小鼠致病性无显著差异。(3)Ross-Egfp与LR-Egfp感染Vero细胞,感染后约12h荧光显微镜下观察,LR-Egfp感染的细胞开始出现荧光。感染后约18h,Ross-Egfp感染的细胞开始出现荧光。空斑实验中,感染后48h,LR2006株形成较大的病毒噬斑,而Ross株形成相对较小的病毒噬斑。在置换了两种毒株的结构基因后,LR-Ross与亲本LR2006相比形成了较小的空斑,而Ross-LR与亲本Ross株相比形成了较大的空斑,且与LR2006株空斑大小相同。以上结果表明CHIKV结构蛋白影响了病毒在细胞中的入侵、复制过程。(4)应用拯救病毒建立小鼠模型,Ross-Nano Luc和LR-Nano Luc滴鼻接种6周龄C57BL/6小鼠,Ross组小鼠在感染后第7天出现脑部发光信号,LR2006组始终未观察到小鼠脑部发光信号。Ross组小鼠出现明显中枢神经系统感染症状,并出现死亡;LR2006组症状较轻,仅体重下降,未出现中枢神经系统症状。以上结果表明,Ross株更容易侵犯小鼠中枢神经系统,具有嗜神经性,也是致小鼠死亡的致病性的主要原因。(5)Ross株和Ross-Low株滴鼻接种6周龄C57BL/6小鼠,两组小鼠均在感染后7天出现体重下降,Ross组在感染后第9天出现死亡,Ross-Low组未出现明显中枢神经系统症状,体重轻微下降后逐渐开始恢复。Ross组和Ross-Low组小鼠在14天内的生存率分别为50%和100%,生存曲线有显著差异(P<0.05)。(6)Ross各型突变及Ross、Ross-Low分别感染Vero细胞,其中Ross-E2产生了有别于亲本Ross株的大空斑,其余Ross-E1、E3、NS2、NS3、NS4均为和亲本一致的小斑。而在动物实验中,滴鼻接种6周龄C57BL/6小鼠,Ross-E2、NS3毒力降低,感染后14天生存率为100%,且E2未见明显发病症状,体重变化趋势与Ross-Low组大致相同,与Ross组有显著差异(P<0.05)。其余突变虽有部分毒力下降,但仍有中枢神经系统症状且有小鼠死亡。以上结果说明,CHIKV E2蛋白影响病毒在细胞中的复制效率,同时对小鼠致病性尤其是神经侵袭性有关键作用。结论综上,本课题建立了CHIKV反向遗传学技术,构建了CHIKV神经侵袭性的小鼠模型,初步确定E2蛋白对病毒入侵细胞、复制、以及对小鼠的致病性的关键影响。对于研发抗CHIKV感染与致病的干预策略以及药物疫苗有重要意义。