高原性肺动脉高压是指正常人移居高原后由于低压低氧,引起肺小动脉功能及器质性改变致使肺动脉压力增高。早期高原性肺动脉高压系因急性低压低氧引起的肺小动脉收缩;长期慢性低压低氧则引起肺血管及心室肌重构,最终发展为难治性梗阻性肺动脉高压。低压低氧是高原性肺动脉高压(HAEPH)产生的根本原因。迄今为止,慢性HAEPH的机制尚未完全阐明,而且仍缺乏理想的治疗方法。因此,对慢性HAEPH的发病机制及治疗措施的研究已成为国内外医学研究的热点之一。波生坦(bosentan)是一种相对分子质量低的特异性竞争性的双重内皮素(ET)受体阻滞剂,由加拿大Acetlion公司和美国Genentetch Inc公司联合开发,商品名为Tracleer(全可利)。目前主要用于治疗原发性肺动脉高压和硬皮病相关性肺动脉高压。但是,波生坦是否可以逆转长期低压低氧引起的肺动脉高压,从而达到治疗高原性肺动脉高压的目的,目前尚缺乏相关报道。5-羟色胺(serotonin,5-HT)是肺内的一种缩血管因子,具有促血管平滑肌细胞收缩和增殖的作用。5-HT与5-HT1B受体(serotonin receptor 1B,5-HT1B)结合增加血管平滑肌细胞内磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)的活性从而导致环磷酸腺苷(cAMP)水平下降,引起肺动脉收缩。5-HT可以通过5-羟色胺转运体(serotonin transporter,5-HTT)和/或5-HT1B受体促使肺动脉平滑肌细胞增殖和肥大,引起肺血管重塑。研究已证实:5-HTT和5-HT1B受体均参与了原发性肺动脉高压和常压低氧性肺动脉高压的形成。但是,5-HT、5-HTT和5-HT1B受体在慢性HAEPH形成中的变化以及波生坦对它们的影响却鲜有报道。因此,本课题拟从整体、器官、分子三个层次初步探讨了:(1)波生坦对慢性HAEPH的治疗作用及其机制;(2)慢性HAEPH大鼠体内5-HT、5-HTT和5-HT1B受体的变化,以及波生坦对其变化的影响。一、波生坦降低了慢性HAEPH1.方法(1)采用动物低压低氧舱模拟海拔5000～5500米高度气压环境(大气压约50kPa),建立慢性HAEPH的大鼠模型。健康SD大鼠随机分为6组(每组10只):正常组,模型3周组,模型4周组,模型6周组,安慰剂组和波生坦组。除正常组外,其余各组置于自制低压低氧舱进行间断性低氧,每天8h。模型3周组大鼠、模型4周组大鼠分别于低压低氧舱中饲养3周和4周,模型6周组、安慰剂组和波生坦组大鼠在低压低氧舱中饲养6周。自第4周起,在低压低氧前,分别给予安慰剂组大鼠和波生坦组大鼠生理盐水2ml或波生坦(bosentan)100mg?kg-1?d-1灌胃。(2)用微导管自右颈外静脉插管至右心室及肺动脉,测定平均肺动脉压(mPAP)及右心室收缩期终末压力(RVSP)等肺血流动力学指标。同时放置导联电极记录和监测大鼠心电图(ECG)和心率(HR)等指标。(3)称量大鼠右心室(RV)和左心室(LV)加室间隔(S)重量,以RV/(LV+S)比值反映右心室肥厚程度。称量大鼠全肺重量(PM)和体重(BM),以PM/BM比值反映肺水肿程度。(4)光镜下观察肺小动脉形态学变化,并用图像分析仪测量与呼吸性细支气管及肺泡管伴行的肺小动脉的外径(ED)、动脉中层壁厚(WT),然后计算血管壁中层厚度占血管外径的百分比(WT%),以反映肺血管重建程度。光镜下观察非肌性肺小动脉(直径40～60μm)管壁双层弹力膜的完整性,计算非肌性肺小动脉的肌化程度,反映肺动脉的肌化程度。(5)分别用硝酸还原酶法和放射免疫分析法检测大鼠血液及肺组织NO和ET-1的水平。(6)用化学比色法测定大鼠肺组织中结构性一氧化氮合酶(constitutive NOS,cNOS)和总一氧化氮合酶(NOS)的活性。2.结果(1)大鼠低压低氧3周后己形成肺动脉高压(PAH)。模型3周组大鼠的mPAP及RVSP明显升高,WT%、RV/(LV+S)比值、PM/BM比值以及肺小动脉肌化度均显著增加。光镜下观察,肺小动脉管壁增厚,管腔缩小,发生肌化的肺小动脉数量明显增多。上述指标随低压低氧时间的延长而加重,至6周时更为显著。但各组大鼠HR无明显变化。(2)低压低氧6周后,安慰剂组大鼠的mPAP和RVSP水平均显著高于正常组。而波生坦组大鼠的mPAP和RVSP水平均显著降低,和正常组大鼠相比已没有显著差异。(3)波生坦组大鼠的肺血管重建指标WT%和肺小动脉肌化度均恢复至正常大鼠水平,其右心室肥厚指标RV/(LV+S)比值、肺水肿指标PM/BM比值和安慰剂组大鼠相比均显著降低。(4)低压低氧6周后,安慰剂组大鼠血液和肺组织中NO水平明显降低,而ET-1的水平显著增高。与安慰剂组大鼠相比,波生坦组大鼠血液和肺组织中NO的水平均明显升高。虽然波生坦组大鼠血浆中ET-1的水平高于安慰剂组,但其肺组织中ET-1的水平已经显著下降。(5)安慰剂组大鼠肺组织中cNOS和总NOS的活性明显降低。与安慰剂组相比,波生坦组大鼠肺组织中cNOS和总NOS的活性显著升高,其值和正常组相比没有显著差异。3.结论(1)波生坦不仅显著降低了慢性HAEPH大鼠的mPAP、RVSP,减轻了右心室肥厚和肺水肿,而且成功逆转了肺血管重构。提示:波生坦对慢性HAEPH有明确的治疗作用。(2)波生坦可以降低慢性HAEPH大鼠肺组织中ET-1的含量,增加cNOS和总NOS的活性,从而使大鼠循环和肺组织中NO的含量升高。这可能是波生坦治疗慢性HAEPH的机制之一。二、波生坦对慢性HAEPH大鼠体内5-HT水平及其肺动脉中5-HTT和5-HT1B受体表达的影响1.方法(1) 30只健康SD大鼠随机分为3组(每组10只):正常组、安慰剂组和波生坦组。正常组于常压环境中饲养,其余两组置于低压低氧舱进行间断性低氧,每天8h。自第4周起,在低压低氧前,分别给予安慰剂组大鼠和波生坦组大鼠生理盐水2ml或波生坦(bosentan)100mg·kg-1·d-1灌胃。(2)酶联免疫吸附实验法(ELASA)检测大鼠的无血小板血浆和肺组织中5-HT的水平。(3)免疫组织化学和Western blot法观察大鼠肺动脉和肺组织中5-HTT、5-HT1B受体的表达变化。2.结果(1)和正常大鼠相比,安慰剂组大鼠无血小板血浆和肺组织中5-HT的水平均显著升高。波生坦灌胃3周后,慢性HAEPH大鼠的血浆和肺组织中5-HT的水平均显著降低。(2)免疫组织化学和Western bolt结果显示:和正常组大鼠相比,安慰剂组大鼠肺动脉和肺组织中5-HTT、5-HT1B受体的表达显著增多。而波生坦组大鼠肺动脉和肺组织中5-HTT、5-HT1B受体的表达均低于安慰剂组。3.结论(1)低压低氧不仅引起了大鼠体内5-HT水平的升高而且促使大鼠肺动脉管壁中5-HTT和5-HT1B受体的过度表达。这证实了5-HT系统的激活参与了慢性HAEPH的形成。(2)波生坦既能有效降低慢性HAEPH大鼠体内5-HT水平的升高,又可减少慢性HAEPH大鼠肺动脉中5-HTT和5-HT1B受体的过度表达。这揭示出波生坦治疗HAEPH可能存在另一机制——影响低压低氧引起的5-HT系统的激活。