一、研究背景鲜红斑痣(Nevus Flammeus)又称葡萄酒色斑(port wine stains，PWS)，是一种良性的难治性先天性毛细血管畸形，其发病率约为3-5‰，是仅次于草莓状血管瘤的常见浅表血管性疾病。大部分损害位于面颈部等暴露部位，红斑颜色多随年龄增长而逐渐加深，并出现增厚呈结节样改变，创伤后易于出血，给患者日常生活带来种种不变。病灶面积随身体生长而相应增大，极少发生自发性消退。鲜红斑痣毁损容貌，使患者在面对上学、求职、婚姻、晋升等重大问题时产生极大的心理障碍，终生影响着一个人的生活质量，部分患者病变还可累及其他器官，并发全身性异常如青光眼、癫痫等而导致机体功能障碍。对鲜红斑痣的治疗，病人期望的最佳效果是既能完全去除红斑，同时又能保留皮肤的正常肤色和质地，这也是多年来整形外科医生们的追求。既往的治疗方法如冷冻、同位素敷贴等并发症多而又疗效欠佳已被淘汰，国内外一直在寻找一种能够高选择性损伤病灶毛细血管网而又不损害血管周围正常组织的新的治疗方法。不同激光的选择，不同种族的差异性以及鲜红斑痣病变血管本身的复杂性与多样性是影响鲜红斑痣激光治疗效果的主要因素。自从1985年出现以脉冲染料激光为代表的选择性光热作用治疗方法以来，选择性地治疗鲜红斑痣成为现实，其治疗后不会出现增生性瘢痕，尤其对浅表病灶的效果更好，已成为国内外较为普及的一线治疗方法，但其对颜色较深、血管扩张出现增生的病灶效果较差。光动力疗法(Photodynamic therapy[PDT])弥补了激光疗法的不足，由于光敏剂与激光的双重选择作用，光动力疗法与单纯激光治疗相比具有疗效更佳、损伤更小、适应症更广的显著优点，尤其适用于面积较大，病灶组织变厚增生的鲜红斑痣患者。黄色人种皮肤属于Fitzpatrick皮肤Ⅳ型，黑色素含量较高，治疗后极易出现色素沉着和瘢痕等并发症，与白种人相比有其特殊性。国外学者对白种人鲜红斑痣病变色泽、部位及患者年龄等相关因素对激光疗效的影响分别进行了研究，由于临床采集的病例数各不相同且多数样本在30人以下，得出的结论不尽相同甚至是完全相反的结论，总体上较为零散，不够系统。国内学者多侧重于观察不同的激光治疗鲜红斑痣的疗效，对不同临床表现类别鲜红斑痣的病变血管形态学研究有所涉及，但缺乏深度。近年来，在总结我科十多年来应用激光治疗鲜红斑痣10000余例的临床实践中，我们发现不同病变分型的鲜红斑痣对激光治疗的效果差异很大，粉红色、鲜红色、紫红色或伴有病灶增厚呈结节样改变的鲜红斑痣对激光的反应大不相同，用同一波长、能量密度激光照射紫红色病灶反应良好而鲜红色病灶却可能出现增生性瘢痕和色素沉着等并发症。这些情况表明不同病变分型的鲜红斑痣，其颜色深浅是影响激光疗效的重要因素，而病灶内畸形血管的状况及血管周围的神经分布等多个因素又决定着病灶颜色。分析畸形血管相关参数和神经分布状况与疗效之间的关联程度，已经成为临床亟待研究的课题。临床上常规通过激光治疗前后的照片颜色消退率由医患双方共同来评价疗效，这种方法易受主观影响，统计结果常误差较大，准确性也较差，既不能量化以用于科研交流，更不能及时为临床医生提供客观的疗效预测，导致医疗纠纷时有发生。因此，建立一种客观准确的预测疗效的方法对指导临床治疗有着现实的意义。二、研究目的实验一通过对国人不同颜色表现的鲜红斑痣病理标本进行HE染色及免疫组化检查，并通过计算机图像分析定量测定有关血管和神经分布状况的相关参数，探讨鲜红斑痣病理改变与临床表现的相互关系；实验二通过组织学检查和透射电镜观察光动力疗法对鲜红斑痣真皮浅层毛细血管网的作用，探讨光动力治疗后血管组织学和超微结构的变化；实验三通过Angel-color色素分析软件，定量测定鲜红斑痣及正常皮肤组织在光动力治疗前后的皮肤红色指数，探讨其在评价鲜红斑痣疗效上的作用；实验四在上述工作的基础上，分析新型铜蒸气激光治疗鲜红斑痣的临床效果与病变颜色等有关因素的相关性。三、研究方法实验一黄色人种鲜红斑痣皮肤血管及神经分布的病理组织学研究在我科2005年～2006年门诊就诊的粉红型、鲜红型、紫红型及紫红色伴皮质增厚呈结节样改变的鲜红斑痣患者中每组随机选择12例分别组成粉红型PWS实验组、鲜红型PWS实验组、紫红型PWS实验组及结节增厚型PWS实验组，年龄均在9～40岁，其中男性21名，女性27名，病灶全部位于面部或颈部，不包括伴有各类综合征或曾接受过其它治疗方法的患者。采用2％利多卡因局部麻醉后，用微型环钻采集病灶及对应正常组织，常规固定包埋，切片后行HE染色及免疫组化染色。HE染色切片在光镜下观察组织病理，重点观察畸形血管及血管周围的神经纤维分布。免疫组化染色切片进行计算机图像分析处理，其中以Ⅷ因子标记血管定量测定以下血管参数：平均血管深度，最大血管深度，平均血管／皮肤面积比率，红细胞充盈血管率；以S-100蛋白标记神经纤维定量测定平均神经／皮肤面积比。统计学处理：应用SPSS12．0统计软件分析，实验数据以(?)±S表示。采用完全随机设计资料单向方差分析、多个独立样本非参数检验及配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。实验二光动力治疗对鲜红斑痣血管组织学与皮肤超微结构的影响光动力治疗前四组不同颜色的鲜红斑痣病灶与正常组织HE染色及免疫组化染色方法与观察指标同实验一；部分标本取材后以3％戊二醛固定，超薄切片定位，按透射电镜常规制样观察。对光动力治疗后两个月病灶标本分别进行：1．HE染色切片组织学检查；2．免疫组化染色切片的计算机图像测量分析；3．透射电镜下超微结构观察。统计学处理方法同实验一。实验三鲜红斑痣光动力治疗前后皮肤色度值的测量与评价采用对照测试方法，以病灶对侧正常皮肤作为正常对照，病变区及对照区均采用多点测量计算均数的方法。每位患者于光动力治疗前和治疗后两个月在自然光线下拍摄数码照片，通过Angel-color色素分析软件，系统分析病变区域的皮肤红色指数在正常皮肤、病灶及治疗后两个月病灶的差异，与临床判断结果相比较，评价该软件红色指数定量判断鲜红斑痣疗效的作用。实验四铜蒸汽激光光动力疗法治疗鲜红斑痣的临床应用血卟啉单甲醚(HMME)按3.5～5.0mg／kg静脉推注，5分钟后用铜蒸汽激光器照射病灶，1个光斑照射时间20～40分钟，光斑直径8～9cm，本组病例每次治疗照射2个光斑，如超过光斑范围则需分次治疗，治疗后避光1个月，下次治疗间隔两个月。本组疗效均统计治疗一次后的结果，分析病变颜色分型对光动力疗效的影响。四、研究结果实验一：1．组织学检查：HE染色可见表皮层正常，真皮浅层毛细血管呈群集扩张状。随着病变颜色加深，部分扩张毛细血管延及真皮深层和皮下组织，含红细胞充盈的毛细血管增多。内皮细胞成熟但不增生。2．免疫组化检查：①Ⅷ因子标记的血管阳性染色可见染色呈棕褐色的毛细血管在真皮浅、中层内丰富，大部分呈扩张畸形。②S-100蛋白标记的神经纤维阳性染色可见呈棕褐色的神经束在真皮层分布稀疏，明显较正常皮肤染色少。③计算机图像分析：48例患者病灶的平均血管深度为0.45±0.11mm，最大血管深度为0.64±0.12mm，血管充盈率为10.63％，平均血管／皮肤面积比为11.39％，平均神经／皮肤面积比为2.07％；其中平均血管皮肤面积比在不同临床表现组有统计学差异，而前三项值在临床分组中相比无统计学差别；粉红和鲜红两组的平均神经／皮肤面积比在紫红型鲜红斑痣和结节增厚鲜红斑痣两实验组间有显著差异。实验二：1．光动力治疗后2个月真皮浅层新生血管和纤维组织形态多已恢复正常，但紫红和结节增厚组真皮深层扩张血管仍部分残留。2．电镜观察治疗前毛细血管管腔扩张明显，血管内皮细胞正常；治疗后即刻血管内皮细胞肿胀明显，上皮细胞内可见含大量脂滴的皮脂腺；治疗后2个月含红细胞的微血管较少，新的血管形成，纤维间质中密布皮脂腺。3．治疗后2个月平均血管皮肤／面积比在粉红型PWS实验组，鲜红型PWS实验组之间比较差异无统计学意义，其余各组间两两比较差异均有统计学意义；平均神经／皮肤面积比率在粉红型PWS实验组和鲜红型PWS实验组之间比较差异无统计学意义，其余各组之间两两比较差异均有统计学意义。实验三：对48例鲜红斑痣患者正常皮肤，病灶侧以及治疗2个月后病灶侧皮肤应用BitST AngelColor色斑分析系统测定其皮肤平均红色指数。光动力治疗前4组不同分型鲜红斑痣的皮肤红色指数与其对应正常对照侧的相比都有显著性差异；治疗后2个月粉红、鲜红型PWS实验组皮肤平均红色指数值下降较多，与本组治疗前相比差异均有统计学意义，与其对应的正常对照侧相比均有显著性差异；紫红、结节增厚型PWS实验组治疗后皮肤平均红色指数值下降，与本组治疗前相比差异有统计学意义，与其对应的正常对照侧相比仍有显著性差异。这一结果与临床观察结果相一致。实验四：疗效判断标准按顾瑛法，粉红型PWS实验组治疗效果最佳，其次是鲜红型PWS实验组，紫红型PWS实验组再次之，结节增厚型PWS实验组疗效最低，4组不同分型鲜红斑痣经光动力治疗1次后2级以上疗效分别为77.3％，62.5％，32.1％和0，各实验组间疗效两两比较均有显著性差异。五、研究结论本课题通过对黄色人种鲜红斑痣皮肤血管及神经分布的病理组织学研究，探讨了鲜红斑痣病理改变与临床表现的相互关系，结果提示平均血管／皮肤面积比与临床病变分型有相关性，病灶血管呈进行性扩张可能与毛细血管周围神经分布缺乏导致血管舒缩紧张性丧失有关。光动力治疗靶向性损伤血管内皮细胞，对真皮浅层毛细血管网有高度的选择性破坏作用。BitST AngelColor色斑分析系统的皮肤红色指数在光动力治疗后呈下降趋势，表明该指数可定量评价鲜红斑痣治疗效果。以铜蒸气激光为光源的光动力学疗法治疗鲜红斑痣安全有效，应用前景广阔，治疗效果与病变颜色有关。