随着科学技术的不断发展,当前蛋白质组学技术已经进入了“翻译后修饰”的时代。而作为蛋白质水平的翻译后修饰,通过对蛋白质中特定氨基酸残基位点进行动态的、可逆的化学修饰,改变蛋白活性或者相互作用,并在在细菌的生长代谢、信号传导、抗逆性以及耐药性等多个关键生理活动中起重要作用。目前在约600余种翻译后修饰种类中,蛋白质酰基化修饰最为频繁的属赖氨酸残基,其中包括有甲基化、丙酰化、丙二酰化、丁酰化、豆蔻酰化、乙酰化以及琥珀酰化等多种化学修饰。为了研究酰基化修饰在水产类致病菌—嗜水气单胞菌中的分布及其生物学功能,本论文通过抗体亲和富集与高分辨质谱鉴定技术手段,研究嗜水气单胞菌中蛋白翻译后修饰的分布情况,分别构建了该菌的赖氨酸琥珀酰化和乙酰化修饰蛋白组图谱,并对这些修饰位点与修饰蛋白的功能进行了一定的探讨。研究还结合利用了生物信息学、统计学分析以及免疫学、分子生物学等生物学手段,系统地分析了这两类蛋白质翻译后修饰在参与调控多个重要代谢途径中的分布规律以及对其蛋白质构象与相关功能的影响。具体研究从以下几方面展开:首先,利用抗体亲和技术富集得到嗜水气单胞菌赖氨酸珀酰化肽段,经质谱分析共鉴定得到2174个修饰位点,涵盖了 666个相关蛋白,占该物种总蛋白数据库的16.2%;其中发生高度修饰的蛋白均参与了原核生物进入翻译过程时所需的重要代谢过程以及能量供给的核心枢纽;生物信息学分析发现8个修饰保守Motif模型,其中基序Ksuc.R与Ksuc.K的组合模型分值较高且对邻近疏水性氨基酸存在一定的偏好性;GO功能富集以及亚细胞定位分析发现,该类修饰蛋白大部分存在于细胞胞浆中,且大都参与了核心能量代谢、生物合成、翻译过程以及结合等的重要功能途径;此外,大部分琥珀酰化修饰蛋白结构域均与GO功能、KEGG代谢途径以及蛋白—蛋白互作紧密联系,包括能量代谢通路中磷酸戊糖代谢、TCA循环、糖酵解,以及其他关键代谢途径,如碳代谢、嘧啶代谢、甲烷代谢、核糖体、RNA降解、蛋白外排等;进一步通过对一些蛋白的免疫共沉淀实验,再次证实了修饰蛋白数据的可靠性,预示着该菌很可能通过翻译后修饰直接或间接调控相关蛋白或者酶的活性来参与重要代谢途径,进而影响细菌生长与适应外界环境等生理功能。研究进一步富集赖氨酸酰基化修饰的乙酰化肽段,经质谱分析后共鉴定得到1058个赖氨酸乙酰化蛋白,其中包含了 3451条乙酰化肽段,占总蛋白数据库的25.67%;由生物信息学分析结果可得,在9个乙酰化修饰Motif模型中,基序EKace与DKace的组合模型分值较高,且更偏好与极性带正电荷的K、R组合排列;二级结构分析发现,两种不同酰基化修饰均对α-螺旋局部结构存在一定偏好性现象,而表面亲和能力低于琥珀酰化修饰;GO功能分类与KEGG富集分析得到与琥珀酰化存在差异的代谢途径有:抗生素的生物合成、氨基酸类的生物合成与代谢以及脂肪酸代谢与降解、萜类化合物骨架生物合成和苯甲酸降解等;可见,该两类修饰的发生存在着较好的相关性绝非偶然,可能共同作用于功能蛋白的协调互补。同时,两者之间存在的一定的差异性也预示着其对嗜水气单胞菌的生长、能量供给等代谢途径方面也行使着独特的作用。此外,本论文以调控群体感应Ⅱ型信号分子的关键作用蛋白—S-核糖同型半胱氨酸裂解酶（LuxS）为例,对其功能与酰基化修饰位点展开进一步的研究。在该研究蛋白中,共有3个赖氨酸修饰位点发生了两种修饰现象,其中包括:23位（Suc）、30位（Suc）以及165位（Suc、Ace）,生物信息学分析发现,K23被预测为多核苷酸结合区,而K30、K165均为蛋白结合位区,对整体的蛋白的亲水性、疏水性起到了一定的影响;为了进一步研究其对蛋白生物学功能,利用同源重组法构建获得嗜水气单胞菌luxS基因缺失株,与野生型比较发现其生长趋势较慢,且Ⅱ型信号分子的活性、生物膜的形成、胞外蛋白酶的分泌活性以及对抗生素的敏感性均有明显降低,而溶血性却出现相对增强的现象;进而对模式生物小白鼠、斑马鱼攻毒毒力检测发现,在高剂量活菌注射条件下其致病性呈高于野生型的趋势;为了探索酰基化修饰位点对目标蛋白的功能影响,进一步构建了luxS基因缺失回复菌株,并对相关修饰位点进行单点突变。研究结果发现:LuxS各个相关位点的点突变导致Ⅱ型信号分子的分泌显著下降,在大肠杆菌中表达嗜水气单胞菌LuxS及各点突变质粒菌株中,K23、K30位点比K165位点对LuxS合成Ⅱ型信号分子的影响更为显著,而在嗜水气单胞菌突变株中构建的各点突变菌株中,K23、K165位点比K30影响更大,提示这3个位点均参与了 LuxS蛋白功能的调控,但在不同宿主菌体系中位点修饰的影响可能有所不同。此外,LuxS关键修饰位点的突变也会对其生物膜的形成能力以及与其他细菌之间相互竞争的能力等方面均产生不同程度的影响。综上所述,本论文利用修饰蛋白质组学及生物信息学的方法系统地分析比较了嗜水气单胞菌赖氨酸琥珀酰化和乙酰化修饰位点的规律以及修饰蛋白的分布和参与相关代谢途径的差异情况,并通过对修饰蛋白LuxS的进一步研究,揭示了该修饰对其生物学功能起着重要影响作用。这些发现不仅深化了对细菌常见的酰基化修饰的理解,更对相关修饰蛋白行使的重要功能及所参与的代谢途径研究提供了理论基础,为由致病菌引起的疾病调控提供了新策略与新思路。