研究背景生物医学种植体的表面形貌特征对细胞功能的发挥起重要影响,甚至对于骨整合的发生起到关键作用。目前微米级的表面形态对细胞功能的影响已经被广泛的研究,并且部分研究已经被成功的应用到医用种植体的表面处理当中,微米级别的表面形貌被证实可以通过机械锁结的方式促进骨-种植体的接触,并且还能够增强成骨细胞的功能,最终有较好的骨整合形成。有些微米级的形貌也已经被应用到商业种植体表面,并取得了较好的临床效果,例如经过喷砂酸蚀处理的表面能够有效的促进骨整合的形成。然而有报道指出微粗糙的表面促进成骨细胞的分化抑制成骨细胞的增殖,与光滑组相比较这可能会导致较少的骨量累积,影响骨整合的效果。随着医学种植体表面处理技术的进步,各种类型的纳米形貌都可以较为容易的得到,细胞与纳米级表面形态的互动因为可能更有效的促进细胞的功能而逐渐引起了人们的兴趣,包括纳米管在内的一些纳米级的表面形貌已经引起了很多的关注,这首先得益于二氧化钛纳米管的制作较为容易,费用低并且可以通过控制阳极氧化的电压以及氧化时间,较准确地控制纳米管的直径和长度。这对于研究不同纳米空间对细胞功能的影响是个非常好的模型。有报道指出,具有合适管径的纳米管能够增强骨细胞的功能,虽然关于不同管径纳米管调控细胞功能的问题仍然存在争议。另外二氧化钛纳米管还可以作为各种药物的载体例如生长因子抗生素以及基因等,这恰好能够满足种植体表面生物功能化的需求,以上这些研究显示二氧化钛纳米管在骨种植体方面有良好的应用前景。正如上所述纳米管附加到生物材料表面有着各种优点,但是不同直径的Ti02纳米管对细胞功能的影响不同课题组有着截然不同的报道,因此如何准确的利用不同管径的纳米管有针对性的实现不同的功能是我们将要面临的一个难题。针对牙科种植体更加具体的来讲,那种尺度的表面是最适应骨细胞功能的表达,最适合骨整合的发生呢?这些都值得我们进一步的研究。另外从仿生学的角度考虑,自然组织是分等级的由纳米、微米等结构通过高度有序的方式组成,我们关注的骨组织便是这样的一个典型结构。骨组织中宏观结构的例如松质骨以及皮质骨等所构成,微米级结构包括骨板层、骨单位、以及哈弗氏骨系统,纳米级结构包括非胶原的有机蛋白、纤维状的胶原以及羟基磷灰石晶体。因此,由纳米级别以及微米级组成的分等级医学种植体表面能够更好的模拟人类自然组织的细胞外基质结构,这也许能够为细胞功能的增强提供更加合适的表面形貌。尽管有以上优点,目前仅有较少的研究制作微米/纳米混合结构用于生物医学方面的应用,例如组织工程支架种植体表面形貌以及血管内支架材料,Kubo等使用磁控溅射技术在微米级别粗糙的表面沉积二氧化钛纳米颗粒制的微米/纳米混合结构,该形貌能够增强成骨细胞的附着、粘附、扩展、增殖以及分化等功能。Tan等通过精密加工技术沉积纳米结构的羟基磷灰石于微米级的表面,该结构能够选择性的增强细胞某些功能。通过喷砂酸蚀法(SLA)在种植体表面获得微米级形貌,再通过阳极氧化法在这一经典的种植体表面附加不同管径的TiO2纳米管,得到表面具有TiO2纳米管的微米/纳米混合结构,其生物性能如何,附加纳米管会不会削弱微米级粗糙表面的优点,多大直径的纳米管具有最佳的效果,至今仍然缺少这方面的研究。鉴于以上研究和思考,我们假设在微粗糙的表面,通过附加不同管径的二氧化钛纳米管,形成微纳混合的仿生表面形貌,并且希望通过纳米管来进一步提高细胞在这种表面相关功能的表达,并进一步验证何种直径的纳米管最适合附加在种植体表面。因此在本研究中,我们首先通过喷砂酸蚀法在纯钛表面得到微米级的多孔形貌,随后结合阳极氧化法在微米级粗糙的表面制得具有TiO2纳米管的微米/纳米混合结构,希望通过这种仿生的结构克服两者的缺点结合两者的优点,通过附加不同管径的Ti02纳米管实现对细胞不同功能的选择调控,促进细胞在种植体表面更好的发挥功能,最终能够提高骨整合的形成,为开发更好的种植体表面形貌,提高种植体的生物学活性,促进种植体-骨结合的形成提供相关的理论依据。研究目的1.探讨表面具有不同直径TiO2纳米管且具有微纳混合结构的形貌对MG63成骨细胞功能的影响。2.探讨微纳混合表面最适合骨整合的TiO2纳米管直径。研究方法1.微纳混合结构的制作及表征的检测(1)微米级表面形貌的制作通过喷砂酸蚀法在钛片及种植体表面获得微米级粗糙的表面。(2)微米表面形貌叠加纳米管的制作通过阳极氧化法在微米级粗糙的表面上分别附加30nm、50nm、80nm不同管径的纳米管,得到表面具有TiO2纳米管的微纳混合形貌。(3)微纳混合结构表征的检测：通过扫描电镜观察、表面轮廓测量仪、水接触角分析仪等手段对不同处理组的钛片表面进行表面形貌、表面粗糙度以及表面亲水性进行检测。以评估不同组钛片表面理化性能的差异。2.具有不同直径Ti02纳米管的微纳混合表面其生物学性能的体外研究(1)蛋白吸附能力的检测牛血清白蛋白(BSA) V在本研究中作为模型蛋白,用于蛋白质吸附实验。BCA法在波长为562nm下测定OD值,根据标准曲线计算蛋白吸附率(百分比)。(2)细胞学实验选取MG63成骨细胞系用于本实验,将细胞以2.4×104/cm2接种到钛片上,在不同时间点,通过荧光染色剂染色,荧光显微镜观察细胞早期粘附以及细胞骨架伸展情况,电镜观察细胞形态变化,MTS试剂盒检测细胞增殖,荧光定量PCR检测成骨基因在不同组细胞的表达情况,以评估不同组钛片表面细胞生物活性。3.以比格犬动物模型研究表面为不同直径TiO2纳米管且具有微纳混合结构的种植体对早期骨整合的影响动物实验以比格犬为动物模型,将四组不同表面的种植体(SLA组,SLA+30nm组,SLA+50nm组,SLA+80nm组)植入比格犬胫骨上端,在每侧胫骨各植入不同组植体一枚共四枚植体,分别在术后第2、4周时处死动物,收获标本。将带有种植体的骨组织标本制作不脱钙的硬组织切片,行甲苯胺蓝染色,光镜下观察拍片,并计算比较不同组种植体凹槽内新成骨面积率(Bone Area,BA)以及种植体-骨结合率(Bone-to-implant Contact, BIC)。统计分析采用Spss13.0统计软件对各组件样本的表面理化性能、蛋白质吸附、细胞的早期粘附、增殖、成骨基因的表达水平以及BA、BIC进行统计学分析。测定结果以(X±S)表示,同一时间点不同组别的比较采用one-way ANOVA进行分析,用LSD法对各组数据进行多重比较,若经Levene检验,数据不满足方差齐性,则采用方差分析的近似方法Welch法进行统计分析。实验结果1.微纳混合结构理化性能的检测(1)通过喷砂酸蚀法可以获得具有一级孔洞二级孔洞的微米级粗糙表面,在此基础上通过阳极氧化法,控制不同电压可以得到30nm、SOnm、80nm不同管径的纳米管。(2)喷砂酸蚀组(SLA组)其表面边缘锐利,孔洞相对较深,粗糙度为Ra=2.06μm,而经过阳极氧化后,锐利的边缘变得相对光滑,孔洞变浅,并且二级孔洞几乎消失；SLA+30nm组其粗糙度Ra=2.87μm,SLA+50nm组其粗糙度Ra=2.74μm,SLA+80nm组其粗糙度Ra=2.44μm。通过检测1μL ddH2O在各组钛片表面的静态水接触角发现,SLA组其接触角为11°左右,而SLA+30nm组、SLA+50nm组、SLA+80nm组当水滴接触到钛片后,便迅速向四周铺展,其接触角均为0°。2.具有不同直径TiO2纳米管的微纳混合表面其生物学性能的体外实验(1)不同处理组钛片表面蛋白吸附率结果提示：在1、2、6h不同时间点,SLA+30nm组均具有最高的蛋白吸附能力,SLA+50nm次之,而SLA组在四个组中蛋白吸附能力最低。(2)细胞早期粘附能力检测的30min、1h及2h三个时间点中,所有处理组钛片表面的细胞粘附量均随培养时间的延长而增加。其中SLA+30nm组细胞在其表面粘附数量最多,在接种后30min,约有70%的细胞粘附到钛片表面,2h后约有90%左右的细胞已经粘附到钛片表面,细胞早期粘附水平明显高于其他三个组,SLA+50nm组细胞粘附水平明显高于SLA+80nm组,而SLA组细胞粘附能力是四个组中最低的,30min时约有60%左右的细胞粘附到钛片表面,2h后约有75%的细胞粘附到钛片表面。(3)细胞接种到钛片上3h和6h后,通过FE-SEM观察细胞在不同组钛片表面的形态,细胞基本上沿着一级孔洞粘附铺展,而在有纳米管的钛片表面,细胞伸出大量的丝状伪足,尤其是SLA+80nm组细胞不但伸出大量丝状伪足,同时还有较多的板状伪足,SLA组则较少见到这种现象。(4)通过荧光显微镜来观察不同处理组钛片表面细胞骨架的形态,可见在1h观察点,四个处理组表面细胞形态基本一致,呈圆形细胞面积较小,未见明显的细胞骨架形成；然而当细胞粘附到钛片3h后,SLA+30nm组细胞有明显伸展,伸出较多丝状伪足,而此时细胞在SLA+80nm组表面,细胞较1h组虽然有了明显的伸展,但是并没有达到SLA+30nm组的水平；接种后6h SLA+80nm组细胞有了明显的变化不同于其他组,细胞呈不规则形,不再呈圆形或者椭圆形,细胞伸出较长的板状伪足,以及大量的丝状伪足。(5)细胞在不同组表面的增殖能力通过MTS试剂盒来检测,结果显示细胞在SLA+30nm组钛片具有更好的增殖能力,明显高于另外三组,而其他三组之间则没有统计学的差异。(6)荧光定量PCR检测MG63成骨细胞成骨相关基因在不同组的表达情况,在一周时,ALP、OC两个基因SLA+80nm组表达最高,其次为SLA+50nm组,但基因Runx2SLA+50nm组表达最高,其次为SLA+80nm组,随后为SLA组,表达水平最低的为SLA+30nm组；在两周时,基因OC SLA+80nm组表达最高,随后依次为SLA+50nm组、SLA组以及SLA+30nm组,各组之间均有显著统计学差异(P<0.01),基因ALP SLA+80nm组表达水平显著高于SLA组以及SLA+30nm组,但与SLA+50nm组之间没有差异；基因Runx2SLA+50组表达水平最高,显著高于另外三组,随后依次为SLA+80nm组、SLA+30nm组以及SLA组,各组之间均有显著统计差异。3.通过比格犬动物模型检测不同处理表面的早期成骨能力通过对硬组织切片染色检测发现,2周时SLA+80nm其BIC最高可达23%,显著高于另外三组,随后依次为SLA+50nm组为18%,SLA+30nm组为14%,SLA组为12%,各组之间均有统计学差异；4周时BIC最高的仍然是SLA+80nm组为49%,SLA+50nm组为39%,随后为SLA+30nm组及SLA组。2周时BA表达最高的组为SLA+80nm组可达32%,随后依次为SLA+50nm组、SLA+30nm组以及SLA组;4周时BA以及BIC的结果与2周时相同,表达最高的依旧为SLA+80nm组其BA为53%,随后为SLA+50nm组为45%,SLA+30nm组为43%左右,SLA组表达最低为37%;而BIC具体结果SLA+80nm组为49%左右,SLA+50nm组为39%, SLA+30nm组为32%左右,SLA组依旧表达最低为24%。结论：1.通过喷砂酸蚀法结合阳极氧化法可获得表面具有Ti02纳米管的微纳混合结构。2.体外细胞实验表明,微粗糙表面附加小直径纳米管能够促进细胞在其表面粘附增殖,而附加大直径纳米管能促进细胞在其表面向成骨方向分化。3.比格犬动物体内实验证实,SLA+80nm组具有最高的早期骨结合效能。