研究背景:原发性肝癌主要是肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC),是临床上最常见的恶性肿瘤之一,全球发病率逐年增长。我国原发性肝癌的发病人数约占全球的55%,死亡人数位居恶性肿瘤的第二位。原发性肝癌的自然生存期仅为1～3个月。由于起病隐匿,超过80%的患者就诊时已经失去手术机会。能够手术的患者术后2年内复发率可达50%,5年生存率仅为25～39%。影响原发性肝癌的预后的主要因素是其高转移率和高复发率,而转移复发的发生与癌细胞的生物学行为、细胞外基质、机体免疫与肿瘤血管生成等因素密切相关。肝癌的转移与复发是一个多步骤、多因素参与的复杂过程,涉及到细胞基因改变,表面结构、抗原性、侵袭力、粘附能力、血管生成的能力以及肿瘤细胞与宿主、肿瘤细胞与间质之间相互作用等多方面。研究显示,肝癌转移基因、转移相关基因的激活与转移抑制基因的失活在肝癌的侵袭转移中发挥重要的作用。原发性肝癌的手术切除率很低,而传统的非手术疗法如化疗、放射治疗等的疗效又不理想。随着分子生物学技术的不断发展,人们对肝癌发生发展的分子机理的认识不断深入,肝癌的基因治疗逐渐成了肿瘤研究的热点。抑癌基因治疗是通过恢复或添加肿瘤细胞中失活或缺乏的抑癌基因,恢复抑癌基因的功能,从而抑制肿瘤的生长和转移。抑癌基因治疗虽不能使肿瘤消退,但可延缓肿瘤的生长,减低肿瘤的侵袭力,阻止肿瘤转移,增加肿瘤对化疗和放疗的敏感性且对正常细胞无明显的损害作用,安全性较好,在肿瘤的基因治疗中应有较高的应用价值。程序性细胞死亡因子4(programmed cell death 4,PDCD4)是一种新近发现的肿瘤抑制基因。在诱导细胞凋亡的过程中,该基因表达上调并因此被命名。随后的研究显示,拓扑异构酶抑制剂抑制基因的同源染色体编码序列TIS(topoisomerase inhibitor suppressed gene)及人H731、197P15a、鸡PDCD4和大鼠DUG均与小鼠MA-3同源,统称为PDCD4。在鼠表皮细胞JB6转化实验中,PDCD4被发现可以抑制肿瘤细胞增殖和转化,具有肿瘤抑制基因的功能。多数研究显示,PDCD4在恶性肿瘤组织中表达下调或缺失,与恶性肿瘤的进展密切相关,提示PDCD4表达下降或缺失在恶性肿瘤的发生发展过程中可能起重要作用。PDCD4对肿瘤的抑制作用主要通过抑制翻译过程而实现。由于PDCD4的蛋白结构中含有两段MA-3区域,其氨基酸序列与由真核细胞翻译起始因子(eukaryotic initiation factor,eIF)eIF4G-Ⅰ和eIF4G-Ⅱ的MA-3功能区的氨基酸序列相同,因而PDCD4可以竞争性抑制eIF4G,进而抑制翻译过程,进一步抑制蛋白合成,抑制肿瘤细胞的增殖。以往的研究表明,PDCD4可以通过下调丝裂原活化蛋白激酶(mitoge-activated protein kinase,MAPK)及转录因子AP-1的活性。多数研究表明,MAPK及AP-1活性的下降可能导致肿瘤细胞活力的下降及侵袭转移能力的降低。因此,我们推测,PDCD4对肝癌细胞的转移潜能有可能有抑制作用。恶性肿瘤的浸润转移往往伴随着血管的生成。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)具有促进新生血管形成的作用。研究表明,VEGF的表达与肿瘤的微血管数量、局部进展和远处转移密切相关。癌细胞从原发灶脱落、与细胞外基质(extracellular matrix,ECM)粘附并将其降解是恶性肿瘤转移的重要环节。ECM主要由Ⅳ型胶原、糖蛋白及蛋自多糖等组成的网状结构,Ⅳ胶原是其主要支架。ECM的降解必须依赖基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs),其中最主要的就是MMP-2和MMP-9,因为它们的作用底物是Ⅳ胶原。大量的研究表明,肝癌细胞分泌的MMPs在降解细胞外基质,促进肿瘤的生长、浸润和转移中起关键作用。MTA1是一个在肿瘤转移过程中表达上调的基因,是肿瘤相关转移基因MTA家族的成员,主要参与组成具有核小体重塑活性的组蛋白去乙酰基酶(nucleosome remodeling deacetylase,NuRD),对基因转录具有抑制作用,并通过调节雌激素通路、细胞骨架和细胞凋亡等途径促进多种上皮源性肿瘤的侵袭和转移。目的:本课题研究旨在研究PDCD4在不同转移潜能的肝癌细胞株中的表达,并且通过构建表达PDCD4基因的真核质粒载体,并且将重组质粒转染到PDCD4表达水平较低的人肝癌细胞株中,进一步探讨PDCD4对人肝细胞癌的转移潜能的作用,从而为肝癌的治疗寻求一种有利途径。方法:1.PDCD4在不同转移潜能的肝癌细胞中的表达:应用免疫细胞化学方法和Western blots法及实时定量PCR三种方法对三种具有不同转移潜能的人肝癌细胞株MHCC-97H(高转移潜能)、MHCC-97L(低转移潜能)和Hep3B(无转移潜能)中的PDCD4的表达水平进行检测;2.人PDCD4基因的真核表达载体的构建:以正常人肝细胞株L02细胞的cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增PDCD4基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,并进行双酶切鉴定;3.PDCD4对人肝癌细胞株的转移潜能的抑制作用:(1)首先将PDCD4的真核表达质粒在眞核细胞E.coli中扩增,用无内毒素质粒提取试剂盒抽提,用Lipofectamine 2000转染试剂将pcDNA3.1-PDCD4、pcDNA3.1-vector分别转染入PDCD4表达水平低的高转移潜能的人肝癌细胞MHCC-97H中,在含400ug/L G418的选择性培养基中筛选稳定转染的细胞并进行相关检测。利用Western blots法对转染效率进行鉴定。(2)分组:以转染pcDNA3.1-PDCD4的细胞为实验组,转染pcDNA3.1-vector及未转染的细胞为对照组。(3)用MTT方法检测PDCD4对肝癌细胞增殖的影响;用流式细胞术分析PDCD4对细胞周期的作用;(4)用Hoechst33258染色对细胞凋亡进行形态学检测,用流式细胞术对细胞凋亡进行检测;(5)通过transwell小室对转染前后MHCC-97H细胞的迁徙和侵袭能力进行评估;(6)用实时定量PCR法对转移相关基因VEGF、MMP-2、MMP-9及MTA1在转染前后的肝癌细胞中的表达进行检测。结果:1.PDCD4在人肝癌细胞中的表达:(1)免疫细胞化学方法显示PDCD4表达于细胞浆中。PDCD4在人肝癌细胞株MHCC-97H、MHCC-97L和Hep3B的免疫细胞化学染色评分(HSCORE)分别是0.85±0.17,1.46±0.36和1.97±0.29,三者之间有显著性差异;(2)Western blots法分析显示PDCD4在MHCC-97H、MHCC-97L和Hep3B的相对强度RD(relative density)分别为0.053±0.045,0.268±0.067和0.587±0.182,三者之间差异显著;(3)实时定量PCR方法将显示PDCD4在MHCC-97H、MHCC-97L细胞中的表达的相对定量值(relative quantification,RQ)(相对于在Hep3B的表达量)分别是0.126±0.023 and 0.385±0.084,二者之间有显著性差异。2.PDCD4真核表达载体的构建:(1)PCR扩增的特异性片段长度为1 972 bp,以此构建的pGEM-T-PDCD4克隆载体,经限制性内切酶酶切证实载体中带有PDCD4基因的目的片段,与GenBank中的人PDCD4基因cDNA序列一致。(2)重组质粒pcDNA3.1-PDCD4经KpnⅠ/XbaⅠ双酶切后显示5.1 kb和2 000 bp左右的2个条带,证明pdcd4基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中。Western blots分析证实转染有效。3.PDCD4对人肝癌细胞株的转移潜能的抑制作用:(1)PDCD4显著抑制HCC细胞增殖,阻滞HCC细胞周期。MTT实验显示,PDCD4组在490nm的吸光度是0.135±0.011,明显低于空载体组(0.218±0.011)及未转染细胞组(0.242±0.014),P＜0.01。空载体组与未转染细胞组之间无明显差异(P＞0.05)。流式细胞术分析显示,PDCD4阻滞肝癌细胞的细胞周期,G1期及G2期的百分比指数(percentage index,PI)在PDCD4组、空载体组与未转染细胞组分别是27.83±0.95%,42.47±2.90%和44.47±2.37%,PDCD4组与空载体组及未转染细胞组之间有明显差异(P＜0.05),而后两者之间无明显差异。(2)PDCD4促进HCC细胞凋亡。流式细胞术显示,PDCD4组、空载体组及未转染细胞组细胞凋亡率分别是41.27±2.73%、12.61±3.00%和12.61±3.00%;Hoechst 33258染色显示,凋亡细胞百分率在PDCD4组是55.62±10.11%,在空载体组是,6.06±2.06%,未转染组是3.12±0.73%。PDCD4组与空载体组及未转染细胞组之间有明显差异(P＜0.01),而后两者之间无明显差异。(3) PDCD4抑制肝癌细胞迁徙及侵袭能力。迁徙实验显示,平均每视野中迁徙细胞数在PDCD4组是32.00±7.01,明显低于空载体组的174.20±16.64或未转染组的193.60±23.72;在侵袭实验中,平均每视野中的迁移细胞数在PDCD4组、空载体组及未转染细胞分别是10.20±1.39,33.00±4.30和45.00±5.70。PDCD4组与空载体组及未转染细胞组之间有明显差异(P＜0.01)。空载体组与未转染细胞组之间无明显差异(P＞0.05)。(4) PDCD4对转移相关基因的影响:PDCD4抑制VEGF、MMP-9及MTA1基因的表达,对MMP-2的抑制作用不明显。相对于未转染组,PDCD4组及空载体组的VEGF mRNA的相对定量值RQ分别是0.424±0.040和0.900±0.135,两组之间差异显著(P＜0.05);MMP-2 mRNA的RQ分别是0.437±0.020和0.717±0.120,两组之间无明显差异,(P＞0.05);MMP-9 mRNA的RQ分别是0.448±0.098和0.882±0.164,两组之间差异显著(P＜0.05):MTA1 mRNA的RQ分别是0.187±0.083和0.652±0.105,两组之间差异显著(P＜0.05)。结论:我们的结果显示,PDCD4在具有高转移潜能人肝癌细胞株MHCC-97H中的表达水平水平最低,而在无转移潜能的人肝癌细胞株Hep3B中表达最低。PDCD4的表达水平与人肝癌细胞株的转移潜能负相关,提示PDCD4对人肝癌细胞的转移潜能可能有抑制作用。PDCD4可以降低肝癌细胞活力,促进肝癌细胞凋亡,抑制肝癌细胞的迁徙和侵袭能力,并且抑制转移相关基因VEGF、MMP-9及MTA1的表达,提示PDCD4对人肝癌细胞的转移潜能具有抑制作用。意义:有关PDCD4的研究显示,该基因对肿瘤细胞具有抑制作用,可以作为肿瘤治疗的靶点,但是目前有关PDCD4对人肝癌细胞的作用的研究很少。本课题利用已经构建好的不同转移潜能的人肝癌细胞株对PDCD4抑制肝癌细胞转移潜能进行研究,为PDCD4对肝癌的治疗作用提供了有力的依据。以往的研究显示肿瘤转移相关抗原MTA1的表达与肿瘤细胞转移密切相关,我们的研究显示,转染PDCD4后人高转移潜能的肝癌细胞的MTA1表达明显下降,这一结果进一步说明PDCD4可以明显抑制人原发性肝癌细胞的转移潜能。我们的研究有待体内试验进一步证实。