论文部分内容阅读
目的:1.明确SD大鼠窦房结(sinoatrial node,SAN)解剖位置和组织细胞形态学特点后,通过制备稳定SD大鼠病态窦综合征(sick sinus syndrome,SSS)模型,观察SSS大鼠SAN形态结构改变以及SAN区组织中血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)、瞬时感受器电位M7通道(transient receptor potential Melastatin 7,TRPM7)、SMAD家族成员2(Smad2)水平和胶原含量的变化;2.细胞实验观察Ang Ⅱ受体阻断剂氯沙坦对Ang Ⅱ诱导大鼠SAN区组织成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)TRPM7/Smad2信号通路及心肌Ⅰ型胶原(collagen type Ⅰ,Col Ⅰ)、Ⅲ型胶原(collagen type Ⅲ,Col Ⅲ)合成的影响,探讨TRPM7/Smad2对SSS大鼠SAN和心房重塑及CFs细胞胶原合成的可能调控机制。方法:1.通过对组织连续切片,HE染色观察正常SD大鼠SAN组织结构与形态;PASM-Masson染色观察正常SD大鼠SAN及心肌组织胶原分布及含量;免疫组化法与免疫荧光测定正常SD大鼠SAN组织超极化激活的环核苷酸门控通道4(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel 4,HCN4)蛋白表达;利用光学显微镜和激光共聚焦显微镜观察,同一部位分别产生棕黄色染色和绿色荧光说明有HCN4表达;2.通过手术法应用20%氢氧化钠浸润SAN组织制备SD大鼠SSS模型;动物分为5组:1)正常对照组(Control,n=8);2)假手术组(Sham,n=10);3)病态窦房结综合征(SSS)分为三组(SSS A组心率降低20~30%,n=40;SSS B组心率降低31~40%,n=40;SSS C组心率降低41~50%,n=40),对SSS大鼠术后分1、2、3、4周四个观察点,分别用SSS1、SSS2、SSS3、SSS4表示;HE染色观察稳定的SSS大鼠SAN组织结构与形态;Masson染色观察稳定的SSS大鼠SAN与心房心肌胶原分布及含量;免疫组化检测稳定的SSS大鼠SAN及心肌组织HCN4、TRPM7、Smad2表达水平;ELISA法测血清及SAN区组织Ang Ⅱ、Col Ⅰ、Col Ⅲ水平;Real-Time PCR测SAN区组织TRPM7 m RNA表达水平;免疫印迹法(Western-blotting)测SAN区组织TRPM7、Smad2蛋白表达水平;3.组织贴块干涸法培养大鼠SAN区组织CFs细胞;免疫细胞化学及免疫荧光法进行CFs细胞鉴定;ELISA法测CFs细胞上清液胶原水平;Real-Time PCR检测CFs细胞TRPM7 m RNA表达水平;Western-blotting检测TRPM7、Smad2蛋白表达水平;通过转染si RNA(small interfering RNA,si RNA)下调TRPM7表达以及转染质粒DNA载体过表达TRPM7,观察Ang Ⅱ是否通过TRPM7/Smad2影响CFs细胞胶原的合成。结果:1.SD大鼠SAN解剖位置:位于上腔静脉与右心耳交界区界嵴及交界区上端起始部上腔静脉根部壁上,可分为头体尾三部分,头部附在上腔静脉外壁上,体部位于上腔静脉与右心耳交界处的界嵴,尾部位于上腔静脉与右心耳交界处,附在右心耳外壁上,呈新月形;2.SD大鼠SAN组织形态学特征:SD大鼠SAN区组织实质细胞成分主要是P细胞、T细胞、神经节细胞和少量心房肌细胞,头部和尾部体积较小,实质细胞分布疏松,体部体积较大,实质细胞分布较密集;间质有丰富网状纤维组织;SAN表面可见SAN动脉,结内有1~2个分支;SAN周围由疏松结缔组织和脂肪组织包绕,与上腔静脉及右心耳分界清楚;SAN区HCN4免疫组化结果可见SAN组织间隙可见淡染有棕黄色P细胞;HCN4免疫荧光染色可见SAN组织P细胞产生的绿色荧光呈点状、环状或不规则短线状分布于细胞膜上。3.建立SD大鼠SSS模型:1)Control和Sham两组大鼠未见死亡,心率变化无显著差异(P>0.05);SSS C组大鼠死亡率明显高于SSS A组或SSS B组(P<0.05),SSS A组与SSS B组大鼠死亡率无显著差异(P>0.05);SSS A组心率逐渐恢复,至4周基本恢复至术前心率;SSS B组术后2~3周心率趋于稳定,且低于术前心率的31~40%;2)大鼠SAN组织HE染色显示:与Control组相比,SSS1组大鼠SAN组织神经节细胞结构较为清析,神经节间隙可见到少量结缔组织增生及细胞核增大上皮样细胞;SSS2组、SSS3组、SSS4组大鼠SAN组织神经节细胞结构模糊,分界不清,组织中可见大量结缔组织增生,SSS3、SSS4组还可见SAN组织有空泡形成;Masson染色胶原分析结果显示:SSS组心房组织胶原水平呈时间依赖性增加,与Sham组相比,SSS1组大鼠SAN组织及心肌胶原水平均显著增加(P<0.01),SSS3组与SSS4组胶原水平进一步增高(P<0.05);Control组、Sham组及SSS1组间HCN4蛋白表达水平均无显著差异(P>0.05);与Sham组相比,SSS2、SSS3、SSS4组HCN4蛋白表达水平均显著降低(P<0.01)。4.动物实验:1)SSS大鼠血清Ang Ⅱ,SAN区组织Ang Ⅱ和Col Ⅰ、Col Ⅲ水平均呈时间依赖性增加,与control组相比,SSS1组血清Ang Ⅱ及SAN区组织Ang Ⅱ、Col Ⅰ、Col Ⅲ水平均显著增加(P<0.05),SSS大鼠术后3周血清及SAN区组织Ang Ⅱ水平达到峰值;Sham组与Control组之间血清和SAN区组织中的Ang Ⅱ、Col Ⅰ、Col Ⅲ水平均无显著差异(P>0.05);各组血清Col Ⅰ、Col Ⅲ水平无统计学差异(P>0.05);2)免疫组化分析显示:SSS大鼠SAN、右心房组织TRPM7、Smad2表达水平均呈时间依赖性增加,与Control组相比,SSS1组大鼠SAN、右心房组织TRPM7、Smad2表达水平均显著增加(P<0.05),SSS2、SSS3、SSS4组大鼠TRPM7、Smad2表达水平进一步增高(P<0.01);3)Real-Time PCR结果示:SSS大鼠SAN区组织TRPM7 m RNA表达水平呈时间依赖性增加,与Control组相比,SSS1组SAN区组织TRPM7 m RNA表达水平显著增高(P<0.01),SSS2、SSS3、SSS4组大鼠TRPM7 m RNA表达水平进一步增加(P<0.01);Western-blotting结果显示:SSS大鼠SAN区组织TRPM7、Smad2蛋白表达水平呈时间依赖性增加,与Control组相比,SSS1组SAN区组织TRPM7、Smad2蛋白表达水平显著增高(P<0.01),SSS2、SSS3、SSS4组大鼠TRPM7、Smad2蛋白表达水平进一步增加(P<0.01),Sham组与Control组之间两者未见明显差异(P>0.05)。5.细胞实验:1)Ang Ⅱ呈剂量依赖性促进CFs细胞胶原合成;2)氯沙坦呈剂量依赖性抑制Ang Ⅱ诱导的CFs细胞胶原合成;3)Ang Ⅱ促进CFs细胞TRPM7m RNA及Smad2蛋白表达;4)通过转染TRPM7特异性si RNA,减少TRPM7基因表达,抑制了Ang Ⅱ诱导CFs细胞Smad2蛋白表达水平,降低Ang Ⅱ促CFs细胞胶原合成作用;转染TRPM7质粒上调TRPM7表达水平,增强Ang Ⅱ诱导CFs细胞Smad2蛋白表达水平,同时强化Ang Ⅱ诱导CFs细胞胶原合成作用。结论:1.手术法使用氢氧化钠浸润可建立稳定的SSS大鼠模型;2.SSS大鼠可激活SAN区组织肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS),通过TRPM7/Smad2信号蛋白,促进SAN区组织纤维化;3.氯沙坦可抑制Ang Ⅱ诱导的CFs细胞胶原合成及TRPM7/Smad2信号蛋白表达;4.激活TRPM7/Smad2信号通路可能是促进SSS大鼠SAN区心肌纤维化及Ang Ⅱ诱导CFs细胞胶原合成的重要机制。