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第一部分 原发性硬化性胆管炎合并炎症性肠病的临床特征研究目的研究通过比较原发性硬化性胆管炎(Primary Sclerosing Cholangitis,PSC)合并炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease,IBD)的患者和PSC未合并IBD患者临床特征的差异,进一步探讨PSC合并IBD的疾病特点。研究方法纳入2000年1月至2021年1月收治的PSC患者42例,其中合并IBD患者14例。通过电子病案系统收集患者的资料,对其人口学特征、临床表现、伴随疾病、辅助检查及治疗情况进行回顾性分析。研究结果1.42例PSC患者的确诊年龄为43.2±17.5岁,其中有14例合并IBD,发病率33.3%,确诊年龄为41.9±17.1岁。2.PSC合并IBD患者与PSC未合并IBD患者相比较,黄疸、乏力发生率更低,腹泻发生率更高(P均<0.05)。PSC未合并IBD患者ALT、TBil、DBil、TBA、CA19-9水平更高(P均<0.05),而PSC合并IBD患者ANA及粪便潜血的阳性率更高(P均<0.05)。PSC合并溃疡性结肠炎的患者以广泛结肠受累为主。3.PSC合并IBD的患者5-氨基水杨酸、糖皮质激素应用的比例显著升高(P=0.025)。结论1.北京协和医院单中心PSC合并IBD的发病率低于西方国家。2.对于腹泻及粪便潜血阳性的PSC患者进行结肠镜筛查有利于早期IBD的发现和诊断。第二部分 原发性硬化性胆管炎合并溃疡性结肠炎动物模型的构建及其肠道菌群组成、胆汁酸代谢特征分析研究目的通过构建硬化性胆管炎合并急性结肠炎的小鼠模型,进一步探讨其肠道菌群及粪便胆汁酸变化特征,并对差异显著的菌属及胆汁酸进行相关性分析,以寻找在PSC继发结肠炎中发挥重要作用的肠道菌群及胆汁酸。研究方法将10-12周龄的C57BL/6雄性小鼠随机分为四组,分别为正常对照组、急性结肠炎组(DSS)、硬化性胆管炎组(DDC)、硬化性胆管炎合并结肠炎组(DDC联合DSS)。对于建立硬化性胆管炎模型的DDC组给予0.1%DDC(w/w)小鼠生长繁殖饲料喂养4周;对于建立实验性结肠炎模型的DSS组在第4周时给予2.5%DSS(w/v)饮用水5天后,更换正常饮用水2天;对于建立硬化性胆管炎合并结肠炎模型的联合组全程给予4周0.1%DDC(w/w)饲料喂养,然后第4周起给予2.5%DSS(w/v)饮用水干预5天,更换正常饮用水2天,均在第29天上午收集新鲜粪便标本并处死小鼠。干预期间记录小鼠体重、精神状态、粪便情况,处死后统计结肠长度,进行结肠、肝脏组织学评估,检测ALT、ALP、TBil、TBA等血生化指标。完善硬化性胆管炎合并急性结肠炎的小鼠模型评估后,对正常对照组和DDC联合DSS组粪便标本进行16S rDNA测序和粪便胆汁酸靶向代谢组学检测,使用免疫组织化学染色法检测小鼠结肠组织法尼酯X受体(Farnesoid X Receptor,FXR)分布及表达水平。研究结果1.DDC联合DSS诱导的小鼠胆管炎合并急性结肠炎模型的结肠评估方面发现,与DSS诱导结肠炎组相比,DDC联合DSS建模组DAI评分明显升高(P<0.05),结肠长度缩短(P<0.05),而两组间相对体重下降及病理评分无统计学差异(体重P=0.495,病理评分P=0.862)。肝脏评估方面发现DDC联合DSS组ALT、ALP、TBil水平较DDC处理组下降(P均<0.05),肝脏HE染色显示肝脏炎性细胞浸润,大量胆色素沉积,胆管周围胶原沉积,胆管上皮细胞增生,提示DDC诱导小鼠胆管炎发生。2.小鼠粪便16S rDNA结果显示,DDC联合DSS组肠道菌群中存在部分正常对照组不具有的操作分类单元,反映物种alpha多样性的指数如Simpson指数、Shannon指数、Ace指数等均低于正常对照组(P均<0.05),主坐标分析(Principal Co-ordinates Analysis,PCoA)发现两组小鼠粪便的整体菌落结构存在差异。在肠道菌群物种丰度LEfSe差异方面发现DDC联合DSS组拟杆菌属、阿克曼氏菌属、普雷沃氏菌属、Anaerostipes菌属,以及产酸拟杆菌、普通拟杆菌、Paraprevotellaclara 菌种显著富集。3.小鼠粪便胆汁酸靶向代谢组学检测结果显示与正常对照组比较,DDC联合DSS建模组粪便CA、TUDCA浓度显著升高(P均<0.05),GCA、UDCA、isoLCA、12ketoLCA、LCA、βUDCA、α-MCA、HDCA、alloLCA、DCA 浓度显著下降(P均<0.05)。DDC联合DSS建模组小鼠粪便总胆汁酸水平显著下降(P=0.0005)。正交偏最小二乘判别分析显示正常对照组和DDC联合DSS建模组粪便胆汁酸具有明显的分离趋势。基于变量权重值>1和单变量统计分析P值<0.05筛选得到11种差异胆汁酸,包括HDCA、GCA、UDCA、DCA、12ketoLCA、βUDCA、LCA、alloLCA、CA、α-MCA、isoLCA。通过关联性分析发现拟杆菌属、普雷沃氏菌属、Anaerostipes菌属与多数差异胆汁酸呈负相关。4.免疫组织化学染色结果发现结肠胆汁酸受体FXR主要分布在结肠上皮细胞胞核及胞浆上;与正常对照组相比,联合建模组FXR染色程度减轻,FXR表达水平下降。结论1.DDC联合DSS干预可以在胆汁淤积、胆管增生的基础上合并急性结肠炎症,为PSC合并UC的研究提供了一种体内研究模型。2.DDC联合DSS建模小鼠粪便菌群组成发生明显变化,物种alpha多样性低于正常对照组,PCoA发现两组小鼠粪便的整体菌落不同。3.DDC联合DSS建模小鼠粪便胆汁酸谱发生明显变化,粪便总胆汁酸池显著减少,拟杆菌属、普雷沃氏菌属、Anaerostipes菌属与多数差异胆汁酸呈负相关。4.DDC联合DSS建模小鼠结肠胆汁酸受体FXR表达下调,提示FXR在硬化性胆管炎合并结肠炎中发挥一定作用。第三部分胆汁酸受体FXR在原发性硬化性胆管炎合并溃疡性结肠炎发病过程中的作用机制初探研究目的通过构建Fxr基因敲除小鼠进一步探究FXR在硬化性胆管炎合并急性结肠炎中发挥的作用及其可能机制。研究方法1.Fxr-/-及Fxr+/+小鼠体内实验:选取Fxr+/+和Fxr-/-小鼠分为两组,给予4周0.1%DDC(w/w)饲料喂养,第4周起给予2.5%DSS(w/v)饮用水干预5天,后更换正常饮用水2天,构建硬化性胆管炎合并急性结肠炎小鼠模型。第29天处死小鼠,收集小鼠结肠组织,干预期间记录小鼠体重、精神状态、粪便情况,处死后统计结肠长度,进行结肠组织学评估;采用荧光实时定量聚合酶链式反应检测结肠黏膜促炎细胞因子Il-1β、Il-6、Tnf-α表达。通过转录组测序技术检测Fxr+/+组和Fxr-/-组结肠组织基因表达谱的差异,寻找FXR介导的下游潜在信号通路。免疫组织化学染色检测结肠自噬相关蛋白LC3表达水平,Western blot检测结肠机械屏障蛋白E-Cadherin、Cluadin 1蛋白以及结肠自噬相关蛋白LC3、Beclin-1蛋白表达水平。2.体外实验:采用100 ng/ml rhTNF-α刺激HT29细胞12小时构建细胞炎症模型,并采用小干扰RNA敲低FXR,分为对照siRNA组、对照siRNA+rhTNF-α组、FXR siRNA 组、FXR siRNA+rhTNF-α组。Western blot 检测 LC3、Beclin-1 蛋白表达,细胞免疫荧光法检测LC3聚集点。最后,应用生物信息学预测FXR参与调控自噬相关通路的潜在靶基因,通过CUT&Tag实验进一步验证FXR与候选靶基因的结合情况。研究结果1.DDC联合DSS干预后,与Fxr+/+组小鼠相比,Fxr-/-组小鼠相对体重下降、疾病活动指数升高、结肠长度缩短均具有显著统计学差异(相对体重P=0.001,疾病活动指数P=0.0008,结肠长度P=0.0364)。结肠黏膜Il-1β、Il-6 mRNA相对表达水平升高,Tnf-α mRNA相对表达水平下降(Il-1β,P=0.0339;Il-6,P=0.410;Tnf-α,P=0.106)。两组间病理学评分无统计学差异(P=0.916)。2.小鼠结肠组织转录组测序发现Fxr基因敲除后DDC联合DSS建模小鼠众多结肠基因表达改变,差异基因参与了包括铁死亡、紧密连接、自噬等多个过程。结肠组织免疫组织化学染色发现Fxr-/-组结肠上皮细胞LC3表达较Fxr+/+组增多。结肠组织Western blot检测发现Fxr-/-组结肠上皮机械屏障相关蛋白E-Cadherin和Claudin1表达水平较Fxr+/+组下降(P<0.01);自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、Beclin-1蛋白表达较Fxr+/+组明显升高(P<0.05)。3.通过Western blot检测敲低FXR对HT29细胞自噬相关蛋白表达的影响。发现敲低FXR后,在无rhTNF-α刺激的情况下LC3-Ⅱ/Ⅰ比值呈升高趋势,但无统计学差异(P=0.298),Beclin-1未见明显变化;而在rhTNF-α刺激下,LC3剪切显著上调(P=0.0329),Beclin-1蛋白表达呈上调趋势(P=0.0759)。细胞免疫荧光染色显示敲低HT29细胞FXR后,在rhTNF-α刺激下LC3聚集点较对照组增加。4.采用生物信息学预测FXR调控自噬通路的潜在靶基因,发现FXR可能参与调控Mras、Atg9b、Camkk2、Dapk2、Dapk1、Gabarapl1、Map1lc3a基因的转录,CUT&Tag实验证明FXR可以富集ATG9B上游启动子区域。结论1.Fxr基因敲除后,DDC联合DSS建模小鼠结肠炎症加重。2.转录组学分析发现Fxr基因敲除后,小鼠结肠组织包括铁死亡、紧密连接、自噬等在内的众多信号通路发生改变。3.Fxr基因敲除导致DDC联合DSS建模小鼠结肠机械屏障蛋白E-Cadherin、Cluadin 1表达下调,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ比值及Beclin-1表达升高,提示敲除FXR促进自噬。4.体外实验发现敲低HT29细胞FXR促进细胞炎症模型中LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化,促进自噬流。5.生物信息学分析提示Mras、Atg9b、Camkk2、Dapk2、Dapk1、Gabarapl1、Map1lc3a可能作为硬化性胆管炎合并急性结肠炎小鼠模型中FXR调节结肠自噬通路的潜在靶基因。